何立寧，趙興鑫，呂潔，趙義良，魏昆鵬，宋瑞

（石家莊市農(nóng)業(yè)畜牧局，石家莊 050000）

0 引 言

生鮮乳中的黃曲霉毒素產(chǎn)生主要原因是由于奶牛采食了被黃曲霉和寄生曲霉的代謝物污染的飼料后，在奶牛體內(nèi)代謝產(chǎn)氫的羥基化代謝物。歐盟規(guī)定，黃曲霉毒素M 1（簡(jiǎn)稱(chēng)AF M 1）在嬰幼兒配方奶粉和嬰兒特殊醫(yī)用食品中的限量值為0.025μg/kg，在牛奶中的限量值為0.050μg/kg[1]，在我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量（GB 2761-2017）中規(guī)定AF M 1在乳及乳制品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品和孕婦及乳母營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品中的限量均為0.5μg/kg[2]，由此可見(jiàn)準(zhǔn)確測(cè)定AF M 1的含量尤為重要。

測(cè)量不確定度的定義為：表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[3]。本文將參考JJF1059-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的相關(guān)要求，采用GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》第一法開(kāi)展測(cè)量不確定度的評(píng)定，以便得到更加準(zhǔn)確和可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑：

ME203E電子天平，AB Sciex Triple Quad 5500液質(zhì)聯(lián)用儀，Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，粒徑1.8μm），酶聯(lián)免疫親和柱（1 mL），AF M 1標(biāo)準(zhǔn)品（10.1μg/mL,99%），13C17-AF M 1（0.504μg/mL，98.3%）。

1.2 方法

參照GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定》第一法同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行。

1.3 質(zhì)譜參數(shù)

電離源：ESI（+）；檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣173 k Pa；溫度：550℃；噴霧氣：380 kPa；輔助加熱氣：380 kPa；碰撞氣：55 kPa。

1.4 液相色譜條件

流動(dòng)相A為濃度5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（1∶1）；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為10μL；梯度洗脫如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量結(jié)果不確定度的數(shù)學(xué)模型

試樣中AF M 1的殘留量為

表2 流動(dòng)相洗脫梯度表

式中：X為AF M 1的量；ρ為上機(jī)液中AF M 1按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度；V為最終定容體積；f為稀釋因子；m為試樣稱(chēng)樣量。

2.2 不確定度來(lái)源分析

通過(guò)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型的分析，生鮮乳中AF M 1測(cè)定的不確定度因素及其影響來(lái)源如下：

（1）上機(jī)液中AF M 1按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度c引入的不確定度；（2）最終定容體積V引入的不確定度；（3）試樣稱(chēng)樣量m引入的不確定度；（4）樣品中加入內(nèi)標(biāo)引入的不確定度；（5）檢測(cè)儀器引入的不確定度。

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

3.1 AF M 1的質(zhì)量濃度引入的不確定度

3.1.1 由標(biāo)準(zhǔn)品濃度引入的不確定度

通過(guò)AF M 1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)可知，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的準(zhǔn)確度為標(biāo)識(shí)濃度的±0.42μg/mL，屬于正態(tài)分布，包含因子k=2，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10.1μg/mL，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.1.2 由內(nèi)標(biāo)濃度引起的不確定度

通過(guò)AF M 1的內(nèi)標(biāo)物證書(shū)可知，內(nèi)標(biāo)物濃度的準(zhǔn)確度為標(biāo)識(shí)質(zhì)量濃度的±0.008μg/mL,屬于正態(tài)分布，包含因子k=2，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.504μg/mL，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.1.3 引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)物稀釋過(guò)程中引入的不確定度主要來(lái)自移取標(biāo)液和定容時(shí)引入的不確定度。用1 mL的移液器移取質(zhì)量濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 ng/mL的工作液和用1 mL的移液器移取質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，定容至10 mL，得到50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)物工作液。

100 mLA級(jí)容量瓶的容量允許差為±0.1 mL[5]，不考慮溫度對(duì)其膨脹系數(shù)的影響，按均勻分布考慮，k=，可計(jì)算出100 mLA級(jí)容量瓶定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

10 mL A級(jí)容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，不考慮溫度對(duì)其膨脹系數(shù)的影響，按均勻分布考慮，k=，可計(jì)算出10 mL A級(jí)容量瓶定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1 mL移液器經(jīng)檢定后的容量相對(duì)誤差為-0.6%，則該移液器的最大誤差為0.006 mL，按均勻分布考慮，可計(jì)算出該1 mL移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)物稀釋過(guò)程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Ud為

3.1.4 量器校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

分別準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為100 ng/mL的工作液5，10，50，100，200，500μL至10 mL容量瓶中，加入100μL質(zhì)量濃度50 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為 0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。該過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要是通過(guò)移液和定容過(guò)程引入的（見(jiàn)表3）。

表3 不同移液器引入的不確定度計(jì)算結(jié)果

已知10 mL A級(jí)容量瓶定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.00115，則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中量器校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度UVc為

3.1.5 添加過(guò)程中引入的不確定度

配置質(zhì)量濃度為50 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液：取AF M 1同位素內(nèi)標(biāo)（0.5μg/mL）1 mL，用乙腈稀釋至10 mL。用量成為100～1 000μL的移液器準(zhǔn)確移取，查該移液器檢定證書(shū)，其1 000μL的容量相對(duì)誤差為-0.6%，其不確定度為6μL,標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.006。10 mL的A級(jí)容量瓶定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.00115。

在標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中加入100μL質(zhì)量濃度為50 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液。100μL移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0058。

則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中內(nèi)標(biāo)物配置和添加過(guò)程中引入的不確定度UVis為：

3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

測(cè)定質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得其峰面積結(jié)果如表4所示。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-峰面積結(jié)果

以峰面積和濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=133942c-6732.8，R2=0.999，其中斜率為133942，截距為-6732.8，對(duì)樣品進(jìn)行二次測(cè)量，有標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中AF M 1的質(zhì)量濃度為1.730 ng/mL。

取樣液連續(xù)上機(jī)測(cè)試8次，結(jié)果如表5所示。

表5 取樣液連續(xù)上機(jī)測(cè)試8次的儀器測(cè)量結(jié)果

表5可以看出，極差R=11949，屬于A類(lèi)評(píng)定，由于測(cè)量次數(shù)較少，依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采用極差法進(jìn)行評(píng)定，其中n=8，C=2.85，故樣液峰面積測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度UA為

樣液中AF M 1的濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc為

3.2 最終定容體積V引入的不確定度

樣品經(jīng)提取、凈化后，收集全部洗脫液，在50℃氮?dú)庀戮徛抵帘M干，用初始流動(dòng)相定容至1.0 mL。已知1 mL移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.006。

3.3 試樣稱(chēng)樣量m引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，準(zhǔn)確稱(chēng)取4 g混合均勻的樣品，查電子天平檢定證書(shū)，在量程為0～50 g時(shí)，最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布進(jìn)行計(jì)算，則；天平檢定結(jié)果誤差為0.2 mg，則；計(jì)算稱(chēng)樣過(guò)程中所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；由于Um遠(yuǎn)小于其他幾個(gè)分量的不確定度，故舍去。

3.4 樣品中加入內(nèi)標(biāo)引入的不確定度

在樣品中加入100μL質(zhì)量濃度為5 ng/mL的AF M 1同位素內(nèi)標(biāo)工作液。100μL移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0058。

質(zhì)量濃度為5 ng/mL的AF M 1同位素內(nèi)標(biāo)工作液的配置：取AF M 1同位素內(nèi)標(biāo)（質(zhì)量濃度0.5μg/mL）100μL，用乙腈稀釋至10 mL。引入的不確定度包括100μL移液器和10 mL容量瓶，標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.0058和0.00115。

則樣品中加入內(nèi)標(biāo)引入的不確定度UI為0.0083。

3.5 串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度

儀器檢定結(jié)果中，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為3%，k=2，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為UMS=0.03/2=0.015。

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，則生鮮乳中AF M 1檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)不確定度為

5 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

本研究中測(cè)定樣品中的AF M 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.406 μg/kg，可以計(jì)算出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，即Ux=0.406 μg/kg×0.0996=0.040μg/kg；取k=2,此樣品中AF M 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的擴(kuò)展不確定度為U=2Ux=0.08μg/kg。

6 結(jié)果

樣品中AF M 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果用測(cè)量不確定度的形式可表示為（0.406±0.08）μg/kg，取包含因子k=2。