李森　王健　古欽文　彭道琥

摘要 目的：探討寄生軟化湯對骨肉瘤小鼠免疫功能的誘導作用，為腫瘤的中藥輔助治療提供參考。方法：選取昆明種小鼠，隨機分為模型給藥組、模型組、空白模型組、正常組，其中模型給藥組腹腔注射給予25mg/kg順鉑及給予13mg/kg寄生軟化湯灌胃，模型組給予相同劑量的順鉑和生理鹽水，空白模型組和正常組分別給予相同劑量的生理鹽水。療程結(jié)束后統(tǒng)計分析小鼠體重、腫塊近似體積、臟器指數(shù)及T細胞亞群。結(jié)果：與模型組比較，寄生軟化湯可明顯提高骨肉瘤小鼠的體重及CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值（P<0.05）。運用寄生軟化湯的小鼠較模型組腫塊體積減少，胸腺和脾臟指數(shù)增加，但變化并不顯著。結(jié)論：寄生軟化湯對骨肉瘤小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)和誘導作用。中藥與化療聯(lián)合治療腫瘤可增強機體免疫功能，抑制腫瘤生長。

關(guān)鍵詞 寄生軟化湯；骨肉瘤；免疫功能；誘導作用；T細胞亞群；中藥；化療；聯(lián)合治療

AbstractObjective：ToinvestigatetheimmuneinducingactivityofJishengRuanhuaDecoctiononmicewithosteosarcomaandtoprovidereferencesforsynergetictreatmentoftumorwithtraditionalChineseMedicine.Methods：Kunmingmicewererandomlydividedintomodeladministrationgroup，modelgroup，blankmodelgroupandnormalgroup.Themodeladministrationgroupreceivedintraperitonealinjectionof25mg/kgcisplatinandintragastricadministrationof13mg/kgJishengRuanhuaDecoction，andthemodelgroupwasadministratedthesamedosagesofcisplatinandsalinewiththeblankmodelgroupandthenormalgroupbeinggiventhesamedosageofsalinerespectively.Aftertheendofthetreatmentcourse，thebodyweight，approximatevolumeoftumor，organsindexandTcellsubgroupswerestatisticallyanalyzed.Results：Comparedwiththemodelgroup，JishengRuanhuaDecoctioncouldsignificantlyincreasethebodyweightandthepercentageofCD3+Tcell，CD4+Tcell，CD8+TcellandCD4+/CD8+ratioofthemicewithosteosarcoma（P<0.05）.Furthmore，JishengRuanhuaDecoctionreducedthevolumeofthetumorandimprovedtheindexofthymusorspleenwithnoremarkablechanges.Conclusion：JishengRuanhuaDecoctioncouldregulateandinduceimmunefunctionofmicewithosteosarcoma.ThecombinationtreatmentofchemotherapyandtraditionalChinesemedicineenhancedtheimmunefunctionandinhibitedtumorgrowth.

KeyWordsJishengRuanhuaDecoction；Osteosarcoma；Immunefunction；Inducingactivity；Tcellsubgroups；TraditionalChinesemedicine；Chemotherapy；Combinationtreatment

中圖分類號：R289.5；R738.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.050

骨肉瘤是兒童和青少年時期最常見的惡性腫瘤之一，伴有骨惡性度高、生長迅速、早期易轉(zhuǎn)移且治療后易復發(fā)等臨床癥狀而成為醫(yī)學上的一大難題[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，即使采用現(xiàn)有的化療/放療及西醫(yī)輔助治療方案，骨肉瘤患者10年總生存率也僅有60%～70%，且在診斷時，約20%骨肉瘤患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病，嚴重影響人類的健康水平和生命質(zhì)量，因此探尋延緩病程，改善疾病癥狀，提高生命質(zhì)量的治療方案迫在眉睫[3-5]。中醫(yī)藥與西醫(yī)相比在對調(diào)理患者的全身狀況，降低化療的不良反應(yīng)，提高手術(shù)和化療的效果，調(diào)整臟腑失調(diào)，提高患者的免疫力等方面具有其獨到之處[6]。本研究旨在通過統(tǒng)計治療療程結(jié)束后骨肉瘤小鼠體重、腫塊近似體積、臟器指數(shù)及T細胞亞群的變化，分析其免疫狀態(tài)，進而探討寄生軟化湯對骨肉瘤小鼠免疫功能的影響，為中藥輔助治療腫瘤提供臨床依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物昆明種小鼠30只，SPF級，雄性，6～8周齡，體重（20.0±2.1）g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.2藥物寄生軟化湯包括黨參12g、黃芪12g、白術(shù)9g、木香6g、川續(xù)斷15g、狗脊12g、桑寄生12g、丹參15g、當歸9g等多味中草藥。上述中藥水煎2次，濃縮至100mL，置于-4℃冷藏儲存。寄生軟化湯中草藥均購于廣州市中醫(yī)醫(yī)院。順鉑購于南京制藥廠有限公司。

1.1.3試劑與儀器LM8骨肉瘤細胞株購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液（含10%新生牛血清）為美國GIBCO產(chǎn)品。小鼠CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體購自上海江萊生物科技有限公司。EliteESP型流式細胞儀購于美國Coulter公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備LM8骨肉瘤細胞株置于RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)生長至90%融合時采用胰酶消化后計數(shù)，離心后棄上清，加PBS緩沖液混勻調(diào)整骨肉瘤細胞濃度為20×106個/mL。

實驗分為模型給藥組、模型組、空白模型組、正常組。隨機選取24只小鼠，剪去左前腋下毛發(fā)，并采用碘液進行消毒處理。取LM8骨肉瘤細胞懸液0.25mL，注入小鼠左前腋窩皮下。皮下注射后每天肉眼觀察，具有明顯腫瘤結(jié)節(jié)時為造模成功。

1.2.2給藥方法造模成功后開始給藥，其中模型給藥組分別2次/d腹腔注射給藥25mg/kg順鉑（w/w，2.5mg/mL）及1次/d灌胃給藥13mg/kg寄生軟化湯（根據(jù)給藥劑量換算，相當于臨床成人用量的9倍）。模型組分別給予相同劑量的順鉑和生理鹽水，空白模型組和正常組給予相同劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥28d為1個療程。每只小鼠每日灌胃量不超過1.0mL。

1.2.3檢測指標與方法治療療程結(jié)束后稱取小鼠體重，測量腫瘤的最長徑a和橫徑b，并依據(jù)公式V=πab2/6，計算腫塊的近似體積。實驗小鼠摘眼球取血，采用肝素鈉震蕩進行抗凝處理，采用流式細胞儀測定T細胞亞群CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分率。實驗小鼠取血后脫臼處死，摘取完整的胸腺和脾臟，濾紙吸干殘血后稱取質(zhì)量，依據(jù)臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重×100%。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1寄生軟化湯對小鼠體重及腫塊體積的影響

腫瘤對小鼠體重具有抑制作用，正常組小鼠體重與模型小鼠比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型給藥組小鼠體重上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且小鼠自主活動增加，皮毛具有一定的光澤，表明寄生軟化湯對小鼠體重增長具有促進作用。腫塊近似體積數(shù)據(jù)顯示，模型給藥組、模型組腫塊體積與空白模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但模型給藥組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2寄生軟化湯對小鼠免疫功能的影響

2.2.1寄生軟化湯對小鼠臟器指數(shù)的影響模型小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常小鼠相比均有下降。與空白模型組比較，模型組小鼠臟器指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而模型給藥組臟器指數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2.2寄生軟化湯對小鼠T細胞亞群的影響與正常組比較，模型小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分率均顯著下降，表明腫瘤損傷機體免疫功能。與模型組比較，模型給藥組CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值均顯著增加，差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，模型組小鼠CD8+T細胞百分率、CD4+/CD8+比值與空白模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3討論

骨肉瘤患者，尤其是中晚期的化療患者，其自身的免疫功能紊亂低下，而傳統(tǒng)化療對機體免疫系統(tǒng)又具有明顯的抑制作用，給疾病的預后及治療帶來諸多困難[7-8]。中藥輔助化療可明顯緩解腫瘤患者的臨床癥狀，改善生命質(zhì)量及治療耐受性，并在一定程度上控制腫瘤大小，延長患者生存時間，為腫瘤治療提供新的思路與方法[9-11]。中藥可通過激發(fā)、增強或恢復機體特異性或非特異性免疫效應(yīng)機制，促進T細胞因子釋放，誘導細胞凋亡，抑制血管生成，增加T細胞總數(shù)等途徑達到抗腫瘤作用[12-13]。

寄生軟化湯作為治療骨肉瘤的中藥方劑，具有活血消腫，攻堅散結(jié)，減毒增效的療效，其含有多味補益正氣，增強機體免疫功能的中草藥，如黨參、黃芪、白術(shù)、丹參等。單味中草藥夏枯草的提取物對腫瘤細胞具有抑制作用[14]。Usami等[15]報道顯示丹參提取物人參皂苷可以增加小鼠胸腺質(zhì)量，抑制腫瘤細胞新生血管的形成和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞的凋亡。任杰紅等[16]和孫睿等[17]研究人員發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以提高正常小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量，提高機體免疫活性。本實驗中，與模型組比較，寄生軟化湯可以明顯提高骨肉瘤模型小鼠的體重（P<0.05），使小鼠自主活動增加，皮毛具有一定的光澤。此外，口服寄生軟化湯的模型小鼠腫瘤體積減小，胸腺和脾臟指數(shù)增加。同時接受寄生軟化湯和化療治療的小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值與單一化療的模型組比較均顯著增加（P<0.05），這表明寄生軟化湯對骨肉瘤小鼠的免疫功能具有誘導作用，寄生軟化湯與化療聯(lián)合治療與單一化療比較，聯(lián)合治療的抗腫瘤效果更佳。

任一時期的患者，即使是晚期惡性程度比較高的腫瘤患者，中醫(yī)治療也能起到提高患者生命質(zhì)量，延長生命的作用。其用在手術(shù)前后也能有很好的治療效果，防止癌細胞轉(zhuǎn)移及擴散，提高手術(shù)的成功率，減少發(fā)生相應(yīng)的并發(fā)癥[18-20]。用在放療和化療后可以減少其不良反應(yīng)，提升患者自身的免疫力，幫助患者完成整個治療過程，提高治愈的概率。中醫(yī)治療采用藥的藥物通常是純天然的中草藥，藥性較溫和且無刺激，可以貫穿于患者整個治療的過程。

實驗研究表明，化療與中藥聯(lián)合治療在增強機體免疫功能，預防腫瘤轉(zhuǎn)移與復發(fā)，改善患者臨床癥狀和生命質(zhì)量等諸多方面具有一定的療效。李梅等[21]在探討中藥湯劑辨證施治聯(lián)合生長抑素類似物治療晚期胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的療效及安全性實驗中證實中藥湯劑辨證施治與生長抑素類似物在治療晚期胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤方面具有協(xié)同作用，可減輕用藥不良反應(yīng)，可能延長患者的疾病進展時間。張江華等[22]研究表明環(huán)磷酰胺聯(lián)合中藥治療具有抗癌、減輕骨髓抑制作用，拮抗環(huán)磷酰胺的不良反應(yīng)及進一步延長荷瘤小鼠壽命的作用。此外，很多中藥單體聯(lián)合應(yīng)用西藥能調(diào)節(jié)P53、Bcl-2基因家族、c-myc等細胞凋亡基因的表達，從而有效地誘導腫瘤細胞的凋亡[23-25]。

綜上所述，寄生軟化湯對骨肉瘤小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)和誘導的作用，采用中藥與化療聯(lián)合的方法治療腫瘤可改善患者的生命質(zhì)量，抑制腫瘤的生長，增強患者的免疫功能，為腫瘤的中藥輔助治療提供了重要的臨床參考。

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（2017-12-21收稿責任編輯：楊覺雄）