張玉琴，孫 陽，王傳義，李青山，劉要旭，徐秀紅*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

【研究意義】烘烤特性是指煙葉在烘烤過程中表現(xiàn)出的變黃和脫水的速度及同步程度，變黃后是否容易定色等特性，包括易烤性和耐烤性[1]。容易變黃，變黃和脫水協(xié)調(diào)的煙葉易烤性好，反之易烤性差。葉片變黃快且維持不變褐的時(shí)間越長，其耐烤性越好，烘烤特性越好[2]。研究烤煙烘烤特性的遺傳基礎(chǔ)可以為選育烘烤特性好的品種和提高烤煙烘烤品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，對(duì)煙草品質(zhì)育種具有一定的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】煙葉烘烤從外觀看是葉綠素等色素降解的反映，藤田茂隆等[3]以單倍體加倍系為研究材料，提出用變黃指數(shù)來指示煙葉的易變黃性，揭示了烤煙易烤性很可能受一個(gè)主效基因控制，并發(fā)現(xiàn)易烤性與生物堿含量密切相關(guān)。另有研究[4-5]表明烤煙耐烤性與多酚氧化酶活性密切相關(guān)，多酚氧化酶的差異特性主要取決于品種和栽培條件。性狀間的連鎖證明煙葉烘烤特性受遺傳影響[3,6-7]。近幾年國外對(duì)烤煙烘烤特性的研究報(bào)道較少，國內(nèi)對(duì)烘烤特性的遺傳研究有所加強(qiáng)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所利用烤煙組合的四世代(P1、P2、F1、F2)及六世代群體(P1、P2、F1、F2、B1、B2)，初步揭示了烤煙烘烤特性的遺傳規(guī)律，用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，初步定位了與烘烤特性相關(guān)的QTL位點(diǎn)[8-10]。D.Gong等[11]結(jié)合SLAF-Seq開發(fā)的SNP標(biāo)記與公布的煙草基因組SSR分子標(biāo)記[12-13]構(gòu)建烤煙分子遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)易烤性主效QTL并將其定位到了煙草基因組的第6個(gè)連鎖群上。

植物數(shù)量性狀的主基因+多基因混合遺傳模型廣泛應(yīng)用于水稻[14]、小麥[15]、玉 米[16]、黃瓜[17]、棉花[18]、煙草[19-21]等糧食、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物。利用重組自交系對(duì)烤煙烘烤特性進(jìn)行遺傳分析的研究尚未有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以烤煙品種云煙85和大白筋599構(gòu)建的重組自交系群體為試驗(yàn)材料，利用“主基因+多基因”的植物數(shù)量性狀遺傳分析方法，對(duì)烤煙易烤性、耐烤性的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】為烤煙烘烤特性QTL精細(xì)定位及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用烘烤特性好的烤煙品種云煙85作為母本(P1)，烘烤特性差的大白筋599作為父本(P2)，從F1單株上收取自交種子，單粒傳法獲得F2∶7代重組自交系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地種植168個(gè)F2∶7代重組自交系。試驗(yàn)地土壤類型為棕壤，偏砂質(zhì)土。年平均降雨量750 mm，年平均氣溫12 ℃。試驗(yàn)地土壤肥力狀況：堿解氮59.45 mg/kg，有效磷23.60 mg/kg，速效鉀106.33 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量0.97 %，pH5.29，氯離子6.80 mg/kg。煙田行距1.2 m，株距0.5 m，留葉數(shù)20片，按照優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)要求進(jìn)行田間管理。試驗(yàn)按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。RIL家系每小區(qū)種植10株，共30株，親本每小區(qū)種植20株，共60株。待到中部煙葉(10～11葉位)成熟后，RIL家系的每個(gè)重復(fù)取5片調(diào)查烘烤特性，親本的每個(gè)重復(fù)取10片調(diào)查烘烤特性。

1.2.2 烘烤特性調(diào)查方法 采用煙葉成熟期暗箱試驗(yàn)[1]作為烘烤特性的測定指標(biāo)。待煙葉成熟后，將其掛在保持室溫的暗箱中，每24 h記錄1次變黃比例和變褐比例，累計(jì)測9次。取24、48、72、96 h的變黃面積計(jì)算變黃指數(shù)(YI)，YI=ΣY/n，Y表示每次的黃色面積比例，n表示測量次數(shù)。變黃指數(shù)越大，表示易烤性越好。從開始變褐進(jìn)行變褐面積統(tǒng)計(jì)，變褐指數(shù)BI=ΣB/n，B表示變褐指數(shù)，n表示測量次數(shù)。變褐指數(shù)越小，表示耐烤性越好。

1.3 數(shù)據(jù)分析

方差分析采用SPSS 23.0，頻率分布和曲線擬合采用Origin軟件。遺傳數(shù)據(jù)采用主基因+多基因的植物數(shù)量性狀混合遺傳模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體烘烤特性的表型結(jié)果

2.1.1 烘烤特性指標(biāo)的方差分析 從表1可知，變黃指數(shù)在親本間存在高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在親本內(nèi)重復(fù)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1=0.9065，P2=0.9174)。變褐指數(shù)在親本間有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在親本內(nèi)重復(fù)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1=0.9922，P2=0.8696)，說明親本在易烤性、耐烤性性狀上存在真實(shí)有效的遺傳差異。偏度和峰度的絕對(duì)值均少于1，說明變黃指數(shù)和變褐指數(shù)在親本內(nèi)的分布均服從正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的分布要求[22]。RIL家系間變黃和變褐指數(shù)均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0001)，說明烤煙烘烤特性在家系間存在穩(wěn)定的遺傳差異，可以進(jìn)行數(shù)量性狀的遺傳分析。

表1 父母本及重組自交系烘烤特性指標(biāo)分析

注：同行標(biāo)有A、B者表示親本間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Note：The same lines label A and B indicate a statistically significant difference between the parents (P<0.01).

Y:變黃指數(shù)；B:變褐指數(shù)圖1 變黃指數(shù)、變褐指數(shù)在重組自交系群體中的次數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of yellow index and browning index in RILs population

2.1.2 RIL群體烘烤特性指標(biāo)的頻率分布 由圖1可以看出變黃指數(shù)和變褐指數(shù)在RIL群體中呈現(xiàn)連續(xù)分離，且均出現(xiàn)超親現(xiàn)象，說明烘烤特性受多基因遺傳或基因互作的影響。擬合曲線呈現(xiàn)單峰明顯的偏態(tài)分布，說明易烤性、耐烤性的遺傳可能受主基因控制。

2.2 烘烤特性最優(yōu)模型選擇與檢驗(yàn)

2.2.2 耐烤性遺傳模型 通過IECM算法獲得烤煙耐烤性RIL群體5類38種遺傳模型的AIC值。根據(jù)AIC準(zhǔn)則，4MG-AI、MX2-AI-AI、MX2-AI-A、MX3-AI-A 4種模型的AIC值較小，可作為備選模型(表2)。依據(jù)統(tǒng)計(jì)量的適合性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在P1、P2和RIL的15個(gè)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量中，4個(gè)模型中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的統(tǒng)計(jì)量個(gè)數(shù)分別為5、4、4、4。綜合確定耐烤性最優(yōu)遺傳模型為MX2-AI-AI，即2對(duì)加性-上位性主基因+加性-上位性多基因模型(表3)。

表2 重組自交系群體烘烤特性指標(biāo)不同遺傳模型的AIC值

續(xù)表2 Continued table 2

模型Model變黃指數(shù)Yellowing index變褐指數(shù)Browning index模型Model變黃指數(shù)Yellowing index變褐指數(shù)Browning indexPG-AI1861.6511497.148MX3-AI-A1865.8521489.201PG-A1912.1421542.395MX3-A-A1924.4111649.236MX1-A-AI1863.6561499.152MX3-CEA-A1870.9811544.192MX1-A-A1880.2291544.278MX3-PEA-A1937.7811647.724MX2-AI-AI1860.7571487.8544MG-AI1837.7121477.084MX2-AI-A1859.2111488.2084MG-CEA1953.8721583.833MX2-A-A1882.1851546.2314MG-EEA1864.7811542.701MX2-EA-A1865.5951542.9864MG-EEEA1894.3161502.748

注:帶下劃線的數(shù)字表示備選模型對(duì)應(yīng)的AIC值。

Note:The numbers with underline refer to the AIC values for the candidate genetic models.MG=major gene model, MX=mixed major gene and polygene model,PG=polygene model, A=additive effect, I=interaction (epistasis), E=equal, C=completely, P=partly.

表3 烘烤特性指標(biāo)備選模型的適合性檢驗(yàn)

2.3 烘烤特性的遺傳效應(yīng)分析

2.3.1 易烤性的遺傳效應(yīng)分析 通過對(duì)RIL群體變黃指數(shù)的分析得出，云煙85×大白筋599組合的易烤性受4對(duì)加性-上位性主基因控制，第1、2對(duì)主基因的遺傳效應(yīng)較大，分別為12.89、8.80，易烤性增加的效應(yīng)來源于母本云煙85。第4對(duì)主基因的加性效應(yīng)和基因間的互作效應(yīng)均為負(fù)值，第3、4對(duì)主基因間的互作效應(yīng)較小，其余主基因之間的互作效應(yīng)明顯，主基因遺傳率達(dá)到95.98 %(表4)。

表4 烘烤特性指標(biāo)的模型遺傳參數(shù)

2.3.2 耐烤性的遺傳效應(yīng)分析 對(duì)RIL群體變褐指數(shù)的遺傳分析得出，烤煙組合的耐烤性受2對(duì)加性-上位性主基因+加性-上位性多基因控制，2對(duì)主基因的加性效應(yīng)均為負(fù)值，不耐烤的效應(yīng)來源于父本大白筋599，主基因間的互作為正向效應(yīng)，主基因遺傳率為54.26 %，多基因的遺傳率為17.82 %，主基因加多基因的遺傳率為72.08 %(表4)。

3 討 論

RIL群體烘烤特性的遺傳分析表明易烤性的遺傳符合4對(duì)加性-上位性主基因模型，遺傳效應(yīng)以第1、2對(duì)主基因的加性效應(yīng)為主，易烤性增加的效應(yīng)來源于母本云煙85，主基因遺傳率很高，有利于QTL位點(diǎn)的發(fā)掘和應(yīng)用。譚效磊[8]通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建遺傳圖譜并進(jìn)行QTL定位，發(fā)現(xiàn)4個(gè)與易烤性相關(guān)的QTL，均為正向加性效應(yīng)，可解釋的表型變異范圍為7.57 %～9.26 %。D.Gong等[11]利用F2、F2∶3群體的表型結(jié)果，定位到2個(gè)共同的易烤性主效QTL，可解釋的表型變異率分別為19.3 %～27.3 %、15.2 %～25.1 %，并將其定位在煙草基因組的第6個(gè)連鎖群上。

RIL群體的耐烤性遺傳符合2對(duì)加性-上位性主基因+加性-上位性多基因模型，主基因均為負(fù)向加性效應(yīng)，基因間互作效應(yīng)明顯，主基因遺傳率達(dá)到54.26 %。郝賢偉[10]用聯(lián)合分離分析方法，分析控制烤煙耐烤性遺傳的主基因以負(fù)向加性效應(yīng)為主，主基因之間有明顯的互作效應(yīng)，并利用200個(gè)F2群體定位到2個(gè)分別位于第3和第9連鎖群的耐烤性相關(guān)主效QTL，可解釋的耐烤性變異率分別為47.01 %和17.49 %，這與RIL群體耐烤性的遺傳分析結(jié)果基本一致。王春凱等[23]基于全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)烤煙烘烤特性位點(diǎn)進(jìn)行發(fā)掘，并對(duì)重要關(guān)聯(lián)區(qū)段進(jìn)行基因篩選和分析，初步預(yù)測了4個(gè)與易烤性相關(guān)的基因和1個(gè)與耐烤性相關(guān)的基因。

烤煙烘烤特性的遺傳分析表明易烤性和耐烤性主要受2對(duì)主效基因的控制，這與前人的研究結(jié)果[8-11]整體一致，又不盡相同。造成結(jié)果差異的原因主要有兩方面：一方面數(shù)量性狀的遺傳往往比較復(fù)雜，影響烘烤特性的因素較多，所以烘烤特性的遺傳也不例外。另一方面，試驗(yàn)群體和模型的不同也會(huì)對(duì)具體結(jié)果造成影響[24]。本研究基于RIL永久群體，采用拓展到4對(duì)主基因的數(shù)量性狀“主基因+多基因”遺傳分析方法[25]分析烘烤特性的遺傳效應(yīng)，有利于發(fā)掘更多的主基因，提供更多的遺傳參數(shù)。且RIL群體的不同家系經(jīng)過重組，基因型得到了固定，這種永久性的分離群體是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和QTL定位研究的理想材料[26-27]。利用RIL群體進(jìn)行烤煙烘烤特性的遺傳分析，不需考慮基因的顯性效應(yīng)，有利于對(duì)控制數(shù)量性狀基因的加性效應(yīng)和上位性效應(yīng)進(jìn)行估計(jì)，為烘烤特性QTL定位提供理論依據(jù)。今后，應(yīng)在已有研究基礎(chǔ)上，利用RIL群體和高通量測序技術(shù)對(duì)烘烤特性QTL進(jìn)行精細(xì)定位，結(jié)合最新煙草基因組測序數(shù)據(jù)，研究將主效QTL定位到相應(yīng)染色體區(qū)段上，進(jìn)行基因的標(biāo)記輔助選擇和分離克隆。

4 結(jié) 論

利用RIL群體對(duì)烤煙烘烤特性進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明烤煙易烤性的遺傳符合4對(duì)加性-上位性主基因模型，主基因遺傳率達(dá)到95.98 %。耐烤性的遺傳符合2對(duì)加性上位性主基因+加性上位性多基因模型，主基因之間互作效應(yīng)明顯，主基因遺傳率為54.26 %，多基因的遺傳率為17.82 %。