(湖南師范大學(xué) 湖南 長沙 410006)

As是一種類金屬，自然界中的As有存在著很多不同的化學(xué)形態(tài)，它在環(huán)境中的賦存形態(tài)及其遷移轉(zhuǎn)化過程很大程度上決定了其毒性[1]。環(huán)境中的無機砷的主要存在形式包括+3價的亞砷酸鹽和+5價的砷酸鹽[2]，As(III)的毒性和遷移性高于As(V)。As(V)能穩(wěn)定存在于土壤中，它在土壤的各種吸附過程中能與礦物組分共沉淀，與As(V)不同的是As(III)則不易在土壤介質(zhì)中形成沉淀[3]。微生物在砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要角色，也在砷的地球化學(xué)過程中起到關(guān)鍵性作用[3-4]。在好氧條件下，34微生物通過細胞內(nèi)As(V)還原酶arsC將As(V)還原為As(III)，再由As(III)運載蛋白arsB/acr3將其排出體外[5]。這類通過解毒機制進行砷還原的微生物叫做細胞質(zhì)As(V)還原微生物。這類微生物能將易吸附于鈣、鐵、鋁等礦物質(zhì)上的As(V)還原為移動性和毒性更強的As(III)，是好氧環(huán)境中參與砷活化和釋放的重要微生物類群[6-7]。

As和Fe的相互作用對As在環(huán)境中的行為具有重要意義。在自然環(huán)境中，主要有兩類礦物會富集As：一類是硫化物礦物，還有一類是鐵氧化物礦物[8]。由于鐵氧化物礦物具有對As有較高的親和力，F(xiàn)e元素和As素也是相互影響，相互作用，因而吸附了As的鐵氧化物常常被用來用于實驗研究。探討還原菌體、含F(xiàn)e礦物參與的As遷移轉(zhuǎn)化過程有助于理解環(huán)境中As、Fe、微生物三者共同參與下的循環(huán)過程，也能幫助我們更好地理解As和Fe的地球化學(xué)作用[9]。

目前，很多研究主要是關(guān)于厭氧微生物對As(V)遷移轉(zhuǎn)化影響[10-11]，而在實際土壤環(huán)境中，土壤表層含氧量較高，存在有很多好氧微生物[12]，而關(guān)于這些好氧微生物(如好氧As(V)還原菌)對As(V)的遷移轉(zhuǎn)化研究很少。另一方面，不少的研究采用的是模擬體系，如用石英砂來模擬實際土壤環(huán)境，而對于實際土壤環(huán)境中As在微生物作用下的遷移轉(zhuǎn)化的研究有限，因此，本實驗是探究在好氧條件下As(V)還原菌對鐵氧化物吸附態(tài)As(V)及土壤中結(jié)合態(tài)As(V)的遷移轉(zhuǎn)化的影響[13]，研究石門雄黃礦區(qū)高As壤中耐As土著微生物的生長化學(xué)特征、土著微生物對不同價態(tài)As的氧化還原作用，是為了讓我們更好的理解耐As土著微生物在As的遷移轉(zhuǎn)化中所起的作用，也為了讓我們更好的研究高As土壤的As釋放過程，同時對豐富As的遷移轉(zhuǎn)化過程提供了參考價值

一、實驗材料與方法

(一)樣品來源

供試土壤為取自湖南石門縣雄黃礦區(qū)As污染土，采樣點是礦區(qū)小門衛(wèi)前地塊。土樣采集后經(jīng)風(fēng)干、研磨后4℃冰箱保存?zhèn)溆?土壤基本元素含量用北京海光儀器LC-AFS 6000測定了采樣點的土壤總As含量，其余元素使用原子吸收光譜儀(Agilent 240 AA)測定。

水鐵礦的制備是根據(jù)Schwertmann提出的方法制備[14]。

表1 土壤基本元素含量表

(二)培養(yǎng)基的制備

分離菌株采用LB培養(yǎng)基：5g L-1酵母膏，10g L-1胰蛋白胨，10g L-1Na Cl,PH為7.4，培養(yǎng)基中加入固體Na2HAsO4·7H2O使得溶液中As(V)的總濃度為200 mg L-1。

固體培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上加入20g瓊脂粉即可。

二、

(一)實驗方法

1.好氧As(V)還原菌的分離與鑒定

在富集耐As(V)微生物的土樣中取1g新鮮土壤放置于100m L無菌錐形瓶中(高壓滅菌)，加入30ml 200 mg/L無菌As(V)溶液，置于30 ℃，200 r/min搖床中振蕩24 h后，取上清液按10-2-10-5梯度稀釋涂布于LB平板。平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天，挑取單菌落，反復(fù)于平板上劃線純化至獲得耐As(V)純菌。將純菌株放于4 ℃冰箱保存以備后續(xù)實驗使用。將得到的耐As(V)菌接種到200 mg/L As(V)濃度的液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為200r/min，30℃搖床培養(yǎng)。取菌液過0.22 μm微孔濾膜，上級檢測As形態(tài)，所用儀器為原子熒光-高效液相色譜聯(lián)用儀(北京海光儀器LC-AFS 6000)，將出現(xiàn)一定濃度As(III)的菌株進行標記，篩選出5株具有較強As(V)還原能力的菌株用于后續(xù)實驗。

實驗采用16S r RNA基因序列分析法，鑒定所分離出的As(V)還原菌株。具體方法為：采用FastDNA? Spin Kit for Soil(土壤基因組DNA提取試劑盒)提取分離得到的純菌株的DNA，并以其DNA為模版對菌株的16S r RNA基因進行PCR擴增，PCR擴增后使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，隨后進行PCR產(chǎn)物的純化與16S r RNA基因測序(湖南擎科)。

2.好氧As(V)還原菌體內(nèi)的As(V)還原酶基因擴增分析

該實驗以分離得到的純菌株經(jīng)過提取后的DNA為模版，以引物P52F和P323R對As(V)還原酶基因arsC進行PCR擴增，擴增引物為P52F和P323R[15]。

3.好氧As(V)還原菌的耐As能力分析

實驗中采用LB培養(yǎng)基，As(V)濃度As(V)為分別為200 mg/L和2 mg/L,研究五株As(V)還原菌SM4，SM9，SM12,SM14,SM15分別在200 mg/L和2 mg/L As(V)溶液中的生長情況。設(shè)置空白對照組(不加微生物)，實驗組菌液與培養(yǎng)基比例為1 m L：50 m L，空白組用無菌超純水取代菌液，反應(yīng)條件均為30℃，200 rpm 振蕩培養(yǎng)。設(shè)置時間梯度為4h，6h,14h,16h,18h,20h。在不同時間段測定OD600值(紫外可見分光光度計，上海精科752N)[16]。

(1)好氧As(V)還原菌對液相As(V)的還原轉(zhuǎn)化

實驗中采用LB培養(yǎng)基，As(V)濃度為200 mg/L,設(shè)置空白對照組(不加微生物)，實驗組菌液與培養(yǎng)基為1 m L：50 m L，空白組用無菌超純水取代菌液。反應(yīng)條件均為30℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)24h。將樣品過0.22μm微孔濾膜，用北京海光儀器LC-AFS6000測定As形態(tài)。

(2)好氧As(V)還原菌對水鐵礦吸附態(tài)As(V)和Fe(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化

在前面的液相實驗中，五株菌株都具有較強的As(V)還原能力，從中選取了一株具代表性的菌株，即SM14，進行接下來的水鐵礦吸附態(tài)As(V)的轉(zhuǎn)化實驗。

實驗過程為1ml培養(yǎng)液離心(15000g，10min)，得到沉淀用滅菌的0.8%的Na Cl溶液清洗，再溶到1mL Na Cl溶液中得到1ml細胞懸浮液，加到19ml無菌水中，后加入0.05g吸附As(V)后的水鐵礦。實驗設(shè)置兩個對照，一個為不加水Fe(Ⅲ)礦的陰性對照，另一個為不接種As(V)還原菌的空白對照?？瞻捉M用無菌超純水取代菌液。反應(yīng)條件均為30℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)24h。將樣品過0.22μm濾膜，用北京海光儀器LC-AFS6500測定As形態(tài)，用紫外可見分光光度計測定Fe形態(tài)。

(3)好氧As(V)還原菌對As污染土壤中的As(V)和Fe(Ⅲ)轉(zhuǎn)化

將石門取回的新鮮土壤反復(fù)三次高壓滅菌，取1g滅菌土與19ml滅菌水制成土壤懸浮液。1ml培養(yǎng)液離心(15000g，10min)，得到沉淀用滅菌的0.8%的Na Cl溶液清洗，再溶到1mlNa Cl溶液中得到1ml細胞懸浮液，加到19 ml的土壤懸浮液中，空白組用無菌超純水取代菌液，30℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)一定間隔時間取樣測定As形態(tài)和Fe形態(tài)。另取一份相同土壤經(jīng)過同樣處理靜置培養(yǎng)7天。將樣品過0.22μm濾膜，用北京海光儀器LC-AFS6000測定As(V)形態(tài)，用紫外可見分光光度計測定Fe形態(tài)。

圖2-2 包含菌株SM4,SM9,SM12,SM14,SM15在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹

(二)結(jié)果與討論

1.好氧As(V)還原菌的鑒定結(jié)果

將測序結(jié)果用BLAST數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行對比鑒定。經(jīng)比對鑒定，分離出五株As(V)還原菌株，它們都屬于芽孢桿菌屬，與Bacillus序列相似度達99%，分別命名為SM4,SM9,SM12,SM14,SM15。得到的對應(yīng)的NCBI數(shù)據(jù)庫編號分別為1937185，1937190，1937193，1937196，1937199。類似地，陳倩等人用瓊脂平板培養(yǎng)法從湖南石門縣雄黃礦區(qū)土壤中篩選出43株耐As(V)細菌。其中27.91%屬于芽孢桿菌屬Bacillus sp.[17]。

測序結(jié)果經(jīng)過軟件Contig Express拼接之后得到拼接序列，Crustal X軟件align之后，用Mega軟件構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，采用方法為neighbor-joining方法，步點值(Boot straps)為1000。該發(fā)育樹結(jié)果表明得到的五株好氧As(V)還原菌株SM 4,SM 9,SM 12,SM 14,SM 15與芽孢桿菌屬的關(guān)系最近，但分屬于不同的種。

2.好氧As(V)還原菌體內(nèi)的As(V)還原酶基因的鑒定

將測序結(jié)果用BLAST數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行對比鑒定。經(jīng)比對鑒定，五株As(V)還原菌內(nèi)均有As(V)還原酶基因，且該還原酶基因?qū)儆赼rsC基因。很多研究表明和Bacillus sp.具有As(V)操縱子arsC，這一基因編碼了As(V)還原酶，在As(V)到As(III)的生物轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用[18]。這與我們的實驗結(jié)果也是一致的，實驗中我們檢測到了arsC編碼基因的存在，片段大小為275bp左右。

3.好氧性As(V)還原菌的耐As能力分析

圖2-3(左)給出了菌株在As(V)濃度為200 mg/L的溶液中菌株的生長情況，CK為無接種微生物對照。由圖可以看出，菌株SM 12，SM 15大致在10 h后開始對數(shù)生長期并在14 h時達到最大生長量，菌株SM 4，SM 9，SM 14大致在14 h后開始對數(shù)生長期SM 14在18 h達到最大生長量，SM 4，SM 9在20 h達到最大生長量。而CK檢測不到菌株的生長。圖2-3(右)給出了菌株在As(V)濃度為2 mg/L的溶液中菌株的生長情況。同樣地CK為無接種微生物對照。由圖可以看出，五株菌株在6 h后開始對數(shù)生長期并在10 h時左右達到最大生長量，說明高As(V)濃度下菌株生長比低As(V)濃度情況下緩慢，但24 h后不同As濃度脅迫下菌株的生長量基本持平，無顯著差異。

圖2-3 200mg/L(左)和2 mg/L(右)As(V)溶液體系中CK以及菌株SM 4，SM 9，SM 12,SM 14,SM 15的生長情況

Figure2-3ThegrowthofCKandstrainSM4,SM9,SM12,SM14,SM15in200mg/Land2mg/LAs(V)solutionsystem

(1)好氧As(V)還原菌對液相As(V)的轉(zhuǎn)化

如圖3-2所示，實驗結(jié)果表明，五株菌株均可以在200 mg/L As(V)溶液中生長，并且都能將As(V)還原成As(III)。隨著培養(yǎng)時間的增加，As(V)濃度慢慢降低，As(III)濃度慢慢升高，并且菌株的生長量是跟其還原量同步的，在菌株大量增長的對數(shù)生長期，其As(V)還原速率也是最快的。五株菌株基本能夠在24h內(nèi)將200 mg/L As(V)完全還原As(III)。其中10-20h是一個快速還原時期，這可能是由于菌株逐漸達到了較大生長量，還原能力不斷增強，此結(jié)果與圖2-2表現(xiàn)出的菌株生長規(guī)律一致。五株菌株SM4,SM9,SM12,SM14,SM15的As(V)還原量相差無幾，都能達到200 mg/L，但是達到最大還原量所需的時間分別是18h，24h，16h，20h，24h，顯然菌株SM12的還原速率最快。As(III)的最大值低于起始的200 mg/L As(V)濃度值可能是因為部分As(III)存在于菌株的細胞液中，暫未釋放到溶液中。

過本章的液相As溶液實驗，可以知道我們所得到的五株好氧型As(V)還原菌能夠在200 mg/L的As(V)溶液中生長并且能夠?qū)s(V)全部還原成為As(III)，隨著培養(yǎng)時間的增加，還原效率降低，一方面是因為菌株經(jīng)過了對數(shù)生長期并且逐漸衰亡，其還原能力下降，另一方面，隨著As(III))濃度的升高，溶液中的毒性不斷增強，抑制了菌株的生長，這點與前面提到的As(III)毒性高于As(V)結(jié)論一致。

圖3-2好氧還原菌SM4,SM9,SM12,SM14,SM15以及CK對液相As(V)的還原轉(zhuǎn)化

Fig.3-2TransformationandreductionofarsenicbyaerobicarsenicreducingbacteriaSM4,SM9,SM12,SM14,SM15andCKinliquidAs(V)

(注：每個小圖左上角SM4,SM9,SM12,SM14,SM15，CK為菌株名稱)

(2)好氧As(V)還原菌對水鐵礦吸附態(tài)As(V)的還原轉(zhuǎn)化

在水鐵礦吸附態(tài)As(V)(200 mg/L)的實驗中，收集到的上清液僅為98.46 ug/L，這足以說明水鐵礦對As(V)具有強大的吸附能力，吸附效率高達99.95%。并且吸附所需的時間僅為24 h，這也說明水鐵礦對As(V)具有很強的親和力，這與前面提到的鐵氧化物與As具有密切關(guān)系觀點一致。這也是本文為何選取水鐵礦作為吸附材料的原因。

在0-10h內(nèi)，As(V)濃度逐漸下降，As(III)濃度逐漸上升，這意味著在此期間As(V)快速被還原成As(III)，10 h即可達到最大As(V)還原量，即As(III)濃度達到了最大值66.72μM(即4.998 mg/L)。并且As(III)濃度達到的最大值遠大于As(V)的最大濃度值。由此可以說明，在此期間，As(V)還原菌株SM14還原了部分吸附在水鐵礦表面的固相As(V)。此時Fe(II)也達到了一個較高值1.168 mM(即65.408 mg/L)。而CK組在0-10 h內(nèi)As(V)濃度由33.16 mg/L下降到26.42 mg/L，這個值遠低于實驗組的As(III)濃度值。并且在CK溶液中檢測不到As(III)的存在，如圖3-3(2)所示。此時溶液中也出現(xiàn)了部分Fe(II)。

如圖3-3(1)所示在10-72h時間段內(nèi)，實驗組As(III)濃度有所下降，As(V)濃度有所上升，這可能是因為被還原到液相中的As(III)又被吸附到水鐵礦的表面，因為水鐵礦對As(V)具有強大的吸附能力。Fe(II)濃度則呈現(xiàn)一種緩慢上升的狀態(tài)。而CK組中As(V)濃度雖然有微小的上升階段，最終也恢復(fù)到與起始濃度值持平的狀態(tài)，F(xiàn)e(II)濃度則呈現(xiàn)一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)，溶液中始終沒有檢測到As(III)，如圖3-3(2)所示。

圖3-3 好氧還原菌SM14(a)和CK(b)對水鐵礦吸附態(tài)As(V)的還原轉(zhuǎn)化

Fig.3-3ReductionandtransformationofadsorptivearseniconferrihydritebyaerobicarsenicreducingbacteriaSM14(left)andCK(right)

3.好氧As(V)還原菌對土壤As(V)和Fe(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化

如圖3-4 B和D所示，在滅菌組中，接種好氧As(V)還原菌株的樣品As(III)濃度和Fe(II)濃度值明顯比未接種樣品As(III)濃度和Fe(II)濃度高，未接種處理中As(III)濃度幾近為零，(As(V)形態(tài)的檢測限為0.05 ug/L)，對比之下，接種好氧As(V)還原菌的處理樣品中As(III)濃度最大值達到了82.46 ug/L，F(xiàn)e(II)濃度也達到了74.21 mg/L，SM14對土壤中的As(V)和Fe(III)起到了明顯的還原作用。

如圖3-4 A所示，原始無處理樣品(未接種未滅菌)，出現(xiàn)了一定濃度的As(III)，As(V)，F(xiàn)e(III)，F(xiàn)e(II)，而滅菌樣品中檢測不到As(III)的出現(xiàn)，說明As(III)的出現(xiàn)與土壤中的土著微生物關(guān)系密切。如圖3-4 A和C所示，在未滅菌組中，接種好氧As(V)還原菌株SM14的樣品As(III)濃度值也比未接種樣品As(III)濃度高，F(xiàn)e(II)濃度值也比未接種樣品Fe(II)濃度高。說明好氧As(V)還原菌株SM14促進了As(V)和Fe(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化。接種組中As(III)和Fe(II)的濃度隨培養(yǎng)時間的增加慢慢，說明還原過程一直在持續(xù)進行。

圖3-5表明，經(jīng)過七天的培養(yǎng)時間，As(V)還原菌株SM14明顯促進了As(V)的溶出與還原。在滅菌組中，經(jīng)過7天時間的培養(yǎng)，最大As(III)還原量達到3524.96 ug/L，而其對照組僅僅為24.19 ug/L，還原量是對照的145.7。說明接種的As(V)還原菌株SM14在As(V)還原到As(III)的過程中起到了十分重要的作用。在未滅菌組中，接種As(V)還原菌株SM14的樣品As(III)濃度為2675.15 ug/L，還原量是對照的3.9倍，對照處理僅為683.45 μg/L。

圖3-4 好氧還原菌SM14對土壤As(V)和Fe(III)的轉(zhuǎn)化

Fig.3-4ReductionandtransformationofAs(V)andFe(III)insoilbyaerobicarsenicreducingbacteriaSM14

(注：A、C土壤未滅菌，其中A未接種菌株SM14，C接種菌株SM 14；B、D土壤進行滅菌，其中C未接種菌株SM14，D接種菌株SM14)

實驗結(jié)果表明，菌株SM14對吸附在水鐵礦表面的吸附態(tài)As(V)具有還原效果。在還原過程中，在無微生物加入的情況下，水鐵礦也會自然溶出部分As(V)，這可能由于吸附了As(V)的水鐵礦發(fā)生的化學(xué)性溶解。但加入As(V)還原菌株后，溶出量明顯增加，As(Ⅲ)濃度值明顯大于As(V)濃度值。這說明，As(V)還原菌株促進了As(V)的溶解，并將As(V)還原成As(III)，除了液相中的As(V)被還原，還有部分固相As(V)被還原。

圖3-5靜置培養(yǎng)7天后好氧還原菌和CK對滅菌土壤(A)和未滅菌原始土壤(B)中As(V)的還原

Fig.3-5ReductionandtransformationofAs(V)insterilesoil(A)andoriginalsoil(B)byaerobicarsenicreducingbacteriaSM14andCKafterstaticculturefor7days

在土壤實驗中，不同處理都能檢測到少量的Fe(II)，說明Fe(III)的還原的出現(xiàn)并不是由于實驗添加的As(V)還原菌所引起的，滅菌處理中Fe(II)的出現(xiàn)可能是Fe(Ⅲ)在還原環(huán)境下發(fā)生的自然過程，也可能是在少數(shù)微生物的作用下發(fā)生的，如Fe(Ⅲ)還原菌。除了滅菌處理中沒有接種As(V)還原菌的對照組沒有檢測到As(III)，其他處理都能檢測到微量的As(III)，這是由于其他處理中都存在著微生物，這個結(jié)果也印證了As(V)的還原是在微生物參與下進行的這一觀點。不管是滅菌處理還是不滅菌處理中，As(V)還原菌株的加入都使得As(III)和Fe(II)的濃度值有所增加，說明該As(V)還原菌確實能促進土壤As(V)和Fe(III)的還原。

結(jié)論

(1)高As濃度下，菌株達到最大生長量所需要的時間比低As濃度長，但是不同的As(V)濃度下，As(V)的最大生長量無顯著性差異。

(2)好氧As(V)還原菌株SM 4,SM 9,SM 12,SM 14,SM 15都對水溶態(tài)表現(xiàn)出一致的還原溶解能力；

(3)相比而言，菌株SM 14對液相As(V)的還原速率較快，對水鐵礦結(jié)合態(tài)和污染土壤結(jié)合態(tài)As(V)的還原速率較低；

(4)菌株SM 14可以同時還原水鐵礦結(jié)合態(tài)Fe(III)成為液相Fe(II)，且對Fe(III)的還原量大于對于As(V)的還原量。

(5)靜置七天培養(yǎng)，As(III)的還原量有很大的提高，在此過程中，好氧As(V)還原菌株SM 14起到了重要作用。