李娣，曹雪曉，蒲位凌，孫立麗，任曉亮

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193)

血必凈注射液是我國(guó)著名的急救醫(yī)學(xué)專(zhuān)家王今達(dá)教授，根據(jù)中西醫(yī)結(jié)合“菌、毒、炎并治”的新理論和臨床經(jīng)驗(yàn)[1]，以血府逐瘀湯組方為基礎(chǔ)研發(fā)而成的中藥復(fù)方注射液。其屬于國(guó)家中藥保護(hù)品種，由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸5味中藥制成，適用于感染誘發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征，即膿毒癥[2]。血必凈注射液成分復(fù)雜，其抗炎機(jī)制具有多靶點(diǎn)作用[3-4]，其中丹參素可明顯抑制鈣離子載體[5]；洋川芎內(nèi)酯Ⅰ可保護(hù)因過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[6]；芍藥苷能調(diào)節(jié)一氧化氮水平及抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載[7-8]；阿魏酸可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷[9-10]；羥基紅花黃色素A可抑制炎癥介質(zhì)釋放和降低炎性因子表達(dá)[11-12]，從而表現(xiàn)抗炎作用。此五種成分結(jié)構(gòu)各不相同，如圖1所示。

圖1 五種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前，血必凈注射液的檢測(cè)方法主要是HPLC[13-15]。本實(shí)驗(yàn)為了更方便有效地控制血必凈注射液的質(zhì)量，根據(jù)其藥理作用和各活性成分發(fā)揮藥理作用的機(jī)制，分別從紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸等五味中藥中選擇具有抗菌消炎活性的羥基紅花黃色素A、芍藥苷、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹參素和阿魏酸為活性指標(biāo)成分[16-20]，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的同時(shí)測(cè)定血必凈注射液多種活性指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，力圖為血必凈注射液全面質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑

血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有效公司，規(guī)格：每支10 mL，三批批號(hào)分別為：1205301、1208171、1311081)；芍藥苷對(duì)照品(天津中新藥業(yè)研究中心，純度≥98%)，丹參素對(duì)照品(天津中新藥業(yè)研究中心，純度≥98%)，洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品(南京拓海生物科技有限公司，純度≥98%)，羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以92.5%計(jì)，批號(hào)：11637-201106)，阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以99.6%計(jì)，批號(hào)：110773-201012)。甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，甲醇(美國(guó)sigma公司，色譜純)，甲酸(美國(guó)Meridian Medical Technologies公司，色譜純)。

1.2 儀器

Waters e2695 system高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，BT1250D分析天平(德國(guó)Sartorius公司)，XW-80A 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5m)；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：1=280 nm(丹參素、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ)，2=390 nm(羥基紅花黃色素A)，3=323 nm(阿魏酸)，4=230 nm(芍藥苷)；進(jìn)樣量：10L；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.3%甲酸水(B)，梯度洗脫。梯度洗脫條件：0～6 min，8%～12%A；6～11 min，12%～18%A；11～26 min，18%～30%A；26～30 min，30%～45%A；30～31 min，45%～8%A；31～40 min，8%A。該色譜條件下，五種指標(biāo)成分的色譜圖如圖2所示，各化合物均得到良好分離。

注：1.丹參素；2.羥基紅花黃色素A；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.洋川芎內(nèi)酯Ⅰ。圖2 280 nm下混合對(duì)照品(A)和血必凈注射液(B)的HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱(chēng)取丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，以50%甲醇定容，得到濃度分別為1034、2190、1082、1024、960 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取各對(duì)照品溶液適量制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取2 mL血必凈注射液完全轉(zhuǎn)移至10 mL 棕色容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，以同樣方法平行制備三份，作供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別吸取混合對(duì)照品溶液適量，用近中性水逐級(jí)稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，搖勻，HPLC測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分的線性回歸方程見(jiàn)表1。

表1 血必凈注射液五種對(duì)照品的線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗(yàn) 配制各成分與測(cè)定樣品響應(yīng)相近的混標(biāo)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6針測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ五種成分的RSD分別為1.05%、0.43%、0.09%、0.09%、0.96%，5種成分的RSD值均小于1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值。丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ五種成分的RSD分別為2.84%、0.83%、0.49%、1.11%、1.25%，各成分RSD值均小于2.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的血必凈注射液樣品1 mL，置于高溫滅菌10 mL的棕色容量瓶中，再分別精密加入適量對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液，甲醇定容，搖勻，制成供試液。平行6份，按2.1項(xiàng)下的色譜條件將上述6份樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ五種成分的平均回收率和RSD值(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算得到血必凈注射液中5種成分的平均回收率為98.85%～103.22%，RSD小于1.27%，表明該方法加樣回收率符合要求。

表2 血必凈注射加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 指標(biāo)成分含量測(cè)定

按照2.2.2項(xiàng)下方法制備分別配制供試品溶液3份(三個(gè)批次)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，根據(jù)2.3.1中的線性范圍計(jì)算可得，分別取三批次的平均值，得到血必凈注射液中丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均含量分別為14.2±0.2、464.5±1.4、1 489.2±4.0、27.8±0.2、 60.6±0.5 μg·mL-1。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

血必凈注射液是由紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、丹參五種藥材提取加工制成的注射液，由于中藥本身的復(fù)雜性，筆者根據(jù)以下兩個(gè)因素選擇了五種成分作為定量測(cè)定的指標(biāo)成分。首先，綜合血必凈注射液相關(guān)藥理作用以及其中各活性成分藥理作用的作用機(jī)制，從其中選擇五種相關(guān)性較大的成分作為定量評(píng)價(jià)指標(biāo)，保證指標(biāo)成分發(fā)揮的藥理作用能夠部分代表血必凈制劑的藥理作用。其次，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)及相關(guān)文獻(xiàn)，從每種藥材中選擇一種具有明顯藥理活性的成分作為指標(biāo)成分，即分別從紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、丹參中選擇了羥基紅花黃色素A、阿魏酸、芍藥苷、洋川芎內(nèi)酯和丹參素，且這五種指標(biāo)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣，有黃酮、有機(jī)酸、萜類(lèi)及內(nèi)酯，這使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有普遍性和適用性。

3.2 色譜條件的選擇

血必凈注射液的成分復(fù)雜，為提高分析靈敏度，減少測(cè)定干擾，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫。發(fā)現(xiàn)甲醇的洗脫效果優(yōu)于乙腈。流動(dòng)相考察了甲醇-0.2%的磷酸水、甲醇-0.2%的甲酸水以及甲醇-0.3%的甲酸水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.3%的甲酸水得到的色譜峰峰形和分離度較好。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，雖然在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜峰最多，反映的成分信息更全面，但因五種成分結(jié)構(gòu)各異，在同一波長(zhǎng)下檢測(cè)靈敏度較低，因此，本實(shí)驗(yàn)選用DAD檢測(cè)器，根據(jù)五種成分的最大吸收波長(zhǎng)，提取不同波長(zhǎng)下的色譜圖分別定量測(cè)定五種成分，用以提高分析準(zhǔn)確度。

4 結(jié)論

在中藥類(lèi)市場(chǎng)國(guó)際化的大趨勢(shì)之下，我國(guó)中藥材的出口貿(mào)易快速增長(zhǎng)，但隨之而來(lái)的質(zhì)量安全問(wèn)題卻阻礙了我國(guó)中藥材產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，使我國(guó)的中藥材安全性遭受到了質(zhì)疑[21]。現(xiàn)行的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要依照化學(xué)藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)模式建立，即選定某一中藥的“有效成分”，建立相應(yīng)的定量標(biāo)準(zhǔn)，然而，對(duì)于成分復(fù)雜的復(fù)方制劑而言，只建立某單一成分的含量測(cè)定在很大程度上存在著片面性。因此，本實(shí)驗(yàn)基于血必凈注射液的藥味組成、化學(xué)成分和藥理作用，選擇具有抗菌消炎活性的丹參素、羥基紅花黃色素、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ為活性指標(biāo)成分，使用HPLC-DAD法在不同波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定5種成分。此方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為血必凈注射液全面質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。