劉慧，鐘芳芳，譚雪，盧青秀，楊光忠，陳玉*

(1.中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.溫州市洞頭區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，浙江 溫州 325000；3.中南民族大學(xué) 民族藥學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430074)

人面果Garciniaxanthochymus是藤黃科Guttiferae植物，是我國傳統(tǒng)傣藥，有驅(qū)蟲、清熱解毒、解食物中毒等功效[1]。人面果果實(shí)、根部及樹葉化學(xué)成分主要含有黃酮[2-4]，三萜[5]和酮[6-8]等化合物，樹葉中含有大量的黃酮化合物，其中雙黃酮類化合物為其主要的結(jié)構(gòu)類型，如Volkensiflavone、藤黃雙黃酮、3，8″-雙柚皮素、白果素、Fukugiside、GB2a glucoside、Fukugetin等[9]。本研究前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人面果葉乙酸乙酯提取物有較好的抗糖尿病活性[10]，雙黃酮類化合物Fukugetin(結(jié)構(gòu)式如圖1)作為人面果葉抗糖尿病的活性成分，對α-淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用，并且是一種新的糖原合成酶GSK-3β的抑制劑，有降血糖的功效[11-12]，可選Fukugetin作為人面果葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分和總黃酮含量測定的對照品。

圖1 化合物Fukugetin的結(jié)構(gòu)式

總黃酮的含量測定一般采用比色法、高效液相色譜法等方法[12]。比色法是《中華人民共和國藥典》中常見的總黃酮測定方法，其中以蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法最為常用[13]。本實(shí)驗(yàn)將NaNO2-Al(NO3)3-NaOH與AlCl3-CH3COONa/CH3COOH比色法進(jìn)行對比，在以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品顯色后穩(wěn)定性差，不宜作為測定方法，故對AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法進(jìn)行研究，對顯色前后的吸收峰(200～900 nm)進(jìn)行比較，分析了以蘆丁和Fukugetin為對照品的AlCl3-CH3COONa /CH3COOH比色法測定人面果葉總黃酮的合理性，并對pH值，緩沖液濃度、顯色溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化研究。因而建立葉中總黃酮含量的測定方法，對人面果葉制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供依據(jù)。

1 材料與儀器

美普達(dá)紫外分光光度計(jì)UV1800C(上海美普達(dá)儀器有限公司)；CP224C萬分之一電子天平(上海奧斯豪儀器有限公司)；島津AUW120D十萬分之一電子天平(島津分析天平有限公司)；亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、冰醋酸、氯化鋁、乙醇均為分析純(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；人面果葉采自云南西雙版納，經(jīng)云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所趙應(yīng)紅主任藥師鑒定為藤黃科藤黃屬植物人面果Garciniaxanthochymus葉；對照品Fukugetin自制，純度達(dá)到98%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H、13C-NMR和ESIMS確定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

稱量4.61 mg Fukugetin于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解定容至刻度(濃度為92.2 μg·mL-1)。

2.2 供試品溶液的配制

精密稱取干燥人面果葉粗粉0.1 000 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱重，水浴回流0.5 h，提取液冷卻，補(bǔ)足減失重量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 兩種顯色方法的比較

2.3.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法(A)

2.3.1.1 顯色方法 用移液管移取對照品溶液1 mL于25 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白。在200～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)最大吸收峰確定測定波長，在510 nm附近有明顯凸躍[14-15](見圖2)。

圖2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法全波長掃描

2.3.1.2 穩(wěn)定性 精密吸取Fukugetin對照品溶液、蘆丁對照品溶液、供試品溶液 各1 mL，按照上述同樣條件操作，顯色后的溶液每隔5 min測定吸收度。發(fā)現(xiàn)蘆丁在該條件下顯色后的溶液在1.5 h內(nèi)都比較穩(wěn)定，而供試品和Fukugetin溶液則很不穩(wěn)定(見圖3)。因此該方法不適合作為人面果葉總黃酮含量的測定方法。

圖3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色放方法的穩(wěn)定性

2.3.2 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法(B)

2.3.2.1 顯色方法 分別移取Fukugetin對照品溶液、蘆丁對照品溶液、供試品溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入0.1 mol·L-1AlCl32 mL、pH 5.2的CH3COONa/CH3COOH緩沖液3 mL，最終用乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下放置15 min。在200～500 nm區(qū)間內(nèi)進(jìn)行波長掃描[16]，根據(jù)最大吸收峰確定測定波長(見圖4)。由圖可見供試品和Fukugetin在415 nm處有最大吸收，而蘆丁則在425 nm處有最大吸收波長，更宜選定Fukugetin作為對照品。

圖4 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法顯色后全波長掃描

2.3.2.2 穩(wěn)定性 精密吸取Fukugetin對照品溶液1 mL，供試品溶液1 mL，按照上述顯色方法進(jìn)行顯色后，每隔5 min測定其吸收度，比較在一段時(shí)間內(nèi)吸光度變化情況。在研究過程中發(fā)現(xiàn)醋酸鈉濃度、緩沖液pH、及緩沖液用量均對吸光度穩(wěn)定性有影響，于是對醋酸鈉濃度、緩沖液pH、及緩沖液用量進(jìn)行考察，選取最優(yōu)的顯色條件。

2.4 AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法的優(yōu)化

2.4.1 醋酸鈉濃度考察 精密吸取對照品溶液4份各1 mL，按2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法操作，分別采用0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-1醋酸鈉配制成的pH 5.5的緩沖溶液，測定415 nm 處吸光度，結(jié)果顯示1.0 mol·L-1醋酸鈉吸收穩(wěn)定性較好(表1)。

2.4.2 緩沖液pH考察 精密吸取對照品溶液4份各1 mL，按2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法操作，分別添加pH 4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖溶液。分別測定415 nm 處吸光度，結(jié)果顯示pH為4.0時(shí)在415 nm處未見明顯最大吸收(見圖5)。隨著緩沖液pH增加在415 nm處的吸光度逐漸增加，但穩(wěn)定性逐漸降低(表2)。再比較pH 5.1、5.2、5.3、5.4、5.5時(shí)在415 nm處的吸光度穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在pH為5.2時(shí)的穩(wěn)定性較好，所以最終選取pH 5.2的緩沖液。

圖5 pH為4時(shí)AlCl3-CH3COONa/CH3COOH顯色法顯色后全波長掃描

2.4.3緩沖液用量考察 精密吸取對照品溶液3份各1 mL，按2.3.2.1項(xiàng)下操作，分別采用1、2、3 mL pH 5.2的緩沖溶液，測定415 nm 處吸光度，結(jié)果顯示當(dāng)加入3 mL緩沖液時(shí)吸光度值最大，且具有較好的穩(wěn)定性(表3)。

表1 醋酸鈉濃度對吸光度穩(wěn)定性的影響

表2 緩沖液pH對吸光度穩(wěn)定性的影響

表3 緩沖液用量對吸光度的影響

綜上所述，最終確定緩沖液測定的最佳條件為1.0 mol·L-1的pH值為5.2的醋酸鈉-醋酸緩沖液3 mL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL容量瓶中，濃度分別為0.046 1、0.092 2、0.138 3、0.184 4、0.230 5、0.276 6 mg·mL-1。分別按照2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法測定415 nm 處吸光度，吸光度分別為0.146 0、 0.297 7、0.449 2、0.591 4、0.746 8、0.902 9。以對照品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，在不同的用量范圍內(nèi)分別呈線性，回歸方程Y=3.2687X-0.005 1(r=0.999 8)，雙黃酮Fukugetin在46.1～276.6 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

2.5.2.1 儀器精密度試驗(yàn) 取同一份對照品溶液，在顯色15 min后連續(xù)測定6次吸光度值，分別為0.544 1、0.544 2、0.544 2、0.545 0、0.545 0、0.545 1，RSD值為0.088%，表明儀器精密度良好。

2.5.2.2 方法精密度試驗(yàn) 對同一份供試品溶液分別取6份，顯色15 min后分別測定415 nm吸光度值，分別為0.532 4、0.532 0、0.533 9、0.539 7、0.534 9、0.544 1，RSD值為0.89%，表明該顯色方法精密度良好。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取人面果葉粗粉0.1 g共 6份，分別按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法測定415 nm 處吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，見表4。平均含量為4.07%，RSD 為1.2%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5.4顯色穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取Fukugetin對照品溶液1 mL，供試品溶液 1 mL，按2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法測定415 nm 處吸光度，每隔5 min測定其吸收度。結(jié)果表明，對照品在60 min內(nèi)穩(wěn)定，供試品在 60 min 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取人面果葉粗粉約0.1 g，分別置于6個(gè)圓底燒瓶中，依次加入4.01 mg·mL-1對照品溶液各1.0 mL，無水乙醇24 mL，再按照2.2項(xiàng)下條件制備供試品，按2.3.2項(xiàng)下顯色方法測定415 nm 處吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表4。能夠滿足分析要求，方法準(zhǔn)確度較高。

表4 Fukugetin的回收率(n=6)

2.6 人面果葉中總黃酮的含量測定

精密稱定人面果葉粗粉0.1000 g，置100 mL容量瓶中，精密加入無水乙醇 25 mL稱重，70 ℃水浴中回流30 min，冷卻后稱重，用無水乙醇補(bǔ)充損失的溶劑重量(精確至 0.001 g)，搖勻，濾過，初濾液棄去，續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取續(xù)濾液 1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.3.2.1項(xiàng)下顯色方法，按照紫外-可見分光光度法(《中華人民共和國藥典》2015版四部通則0401)，在415 nm 波長處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中總黃酮的濃度，進(jìn)一步計(jì)算人面果葉中總黃酮平均含量為3.93%，結(jié)果見表5。

表5 人面果葉總黃酮含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對比了《中華人民共和國藥典》常用的方法：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法，發(fā)現(xiàn)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法在顯色后樣品穩(wěn)定性較差，不適合作為人面果葉總黃酮含量的測定方法。在進(jìn)行AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法研究過程中，分別比較了以蘆丁和Fukugetin為對照品的顯色情況，發(fā)現(xiàn)Fukugetin的最大吸收波長能更好地與供試品重合，且Fukugetin系從人面果葉中分離得到的雙黃酮單體化合物，具有良好的降血糖作用，所以采用Fukugetin作為該法對照品，以提高方法的專屬性。優(yōu)化了AlCl3-CH3COONa/ CH3COOH比色法的顯色條件，確立了人面果葉總黃酮含量測定方法，為后續(xù)人面果葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了依據(jù)。