姬萌霞，邢莉莉，金碧輝，余芝芝，傅曉華，吳瑞芳，黃瓊曉，舒靜

(浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科，杭州 310014)

凍融胚胎移植(FET)因其有避免卵巢過(guò)度刺激、提高累積妊娠率等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為輔助生育技術(shù)(ART)中重要的治療策略。近年來(lái)，ART領(lǐng)域的關(guān)注點(diǎn)逐漸由單一追求妊娠率轉(zhuǎn)移到安全性與成功率兼顧，選擇性單胚胎移植和全胚冷凍策略逐步開(kāi)展，這促使FET周期大大增加[1]。FET的關(guān)鍵在于準(zhǔn)備容受性良好的內(nèi)膜，而雌、孕激素在調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性上起重要作用。影響FET結(jié)局的因素有很多，從胚胎角度講，包括女方年齡、移植胚胎數(shù)目、胚胎級(jí)別等；從內(nèi)膜角度講，包括內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備的用藥方案、種植窗期間雌、孕激素水平等[2]。子宮內(nèi)膜僅在特定的時(shí)間內(nèi)允許胚胎植入，稱為“種植窗”，通常在受精后3～5 d內(nèi)。而種植窗的開(kāi)啟與關(guān)閉主要受雌、孕激素的調(diào)控。那么，在FET過(guò)程中，有必要監(jiān)測(cè)雌、孕激素水平嗎？有學(xué)者認(rèn)為，雌激素過(guò)高或過(guò)低均可能影響胚胎種植[3]；也有學(xué)者認(rèn)為，雌激素濃度不影響妊娠率[4-5]。本文擬探討圍種植期雌激素對(duì)FET結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2016年1月至2017年12月于我中心行FET的362個(gè)周期，根據(jù)內(nèi)膜準(zhǔn)備方案不同分為激素替代組和自然周期組?；颊咂骄挲g為(32.30±4.32)歲，不孕年限(3.91±2.73)年。

二、內(nèi)膜準(zhǔn)備

1.自然周期方案：適用于月經(jīng)周期較規(guī)律、無(wú)排卵障礙的患者。于月經(jīng)周期第9～10天起行B超監(jiān)測(cè)卵泡，直至排卵日。排卵日記為Day 0，開(kāi)始給予黃體酮針劑(浙江仙琚制藥)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，40 mg qd；Day 1起予地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培制藥，荷蘭)10 mg bid；Day 3行卵裂期胚胎移植；Day 5行囊胚移植。

2.激素替代方案：適用于月經(jīng)周期不規(guī)律或排卵障礙的患者。于月經(jīng)周期第3天行B超檢查，如無(wú)影響移植的盆腔異常情況，予戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳，德國(guó))，3 mg，bid，定期B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜形態(tài)及厚度，必要時(shí)加用17β-雌二醇片(芬嗎通，雅培制藥，荷蘭)陰道上藥，用藥12天以上且內(nèi)膜厚度≥ 8 mm時(shí)予孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，轉(zhuǎn)化日記為Day 0，予黃體酮針劑(浙江仙琚制藥)40 mg，qd；Day 1起予地屈孕酮片10 mg bid；Day 3行卵裂期胚胎移植；Day 5行囊胚移植。

兩種方案均于移植日B超測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度及形態(tài)，檢測(cè)移植日及移植后第3天血雌二醇(E2)、孕酮(P)，計(jì)算移植日及移植后第3天P/E2。P/E2=P(nmol/L)×1 000/E2(pmol/L)。比較臨床妊娠組與未妊娠組的種植率和移植日、移植后第3天E2、P水平及P/E2；以移植后第3天E2367 pmol/L為界值，分為E2≤367 pmol/L和E2>367 pmol/L兩組，比較兩組的FET結(jié)局。

三、胚胎冷凍及復(fù)蘇

取卵后72 h觀察胚胎生長(zhǎng)情況，必要時(shí)行囊胚培養(yǎng)，根據(jù)臨床需要進(jìn)行胚胎冷凍。卵裂期胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級(jí)胚胎：卵裂球大小均勻，無(wú)碎片或僅有極少(<10%)碎片；Ⅱ級(jí)胚胎：卵裂球大小略不均勻，碎片率為10%～20%；Ⅲ級(jí)胚胎：卵裂球大小明顯不均勻，碎片率21%～50%；Ⅳ級(jí)胚胎：卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，碎片率≥50%。優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎定義為第3天6細(xì)胞以上的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎；可利用卵裂期胚胎定義為第3天4細(xì)胞以上的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)胚胎。囊胚分級(jí)以Gardner分級(jí)為標(biāo)準(zhǔn)[6]，優(yōu)質(zhì)囊胚定義為第5天囊胚級(jí)別在3BB以上，第6天囊胚級(jí)別在4BB以上。冷凍標(biāo)準(zhǔn)包括優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎、可利用卵裂期胚胎及囊胚。冷凍及復(fù)蘇方法均為玻璃化冷凍。胚胎復(fù)蘇時(shí)，存活細(xì)胞數(shù)>50%即為復(fù)蘇成功，行胚胎移植。

四、妊娠判定及觀察指標(biāo)

胚胎移植12 d查血HCG，移植后35 d行陰道B超檢查。血HCG>5 U/L定義為HCG陽(yáng)性，HCG陽(yáng)性但宮內(nèi)外均未見(jiàn)孕囊定義為生化妊娠，B超下見(jiàn)孕囊定義為臨床妊娠。種植率=B超下孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期/移植總周期數(shù)×100%，生化妊娠率=生化妊娠周期/移植總周期數(shù)×100%。

五、激素測(cè)定

采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定E2和P，試劑盒為BECKMAN機(jī)器專用，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用(±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FET臨床妊娠與未妊娠兩組比較

激素替代方案共有239個(gè)周期，其中臨床妊娠128個(gè)周期，未妊娠111個(gè)周期，兩組患者在移植日內(nèi)膜厚度、移植日E2、P、P/E2，移植后第3天E2、P、P/E2等方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但臨床妊娠組移植胚胎數(shù)及優(yōu)胚數(shù)顯著高于未妊娠組(P<0.05)(表1)。

自然周期方案共有123個(gè)周期，其中臨床妊娠70個(gè)周期，未妊娠53個(gè)周期，兩組患者在移植日內(nèi)膜厚度、移植日E2、P、P/E2，移植后第3天E2、P、P/E2，移植胚胎數(shù)及優(yōu)胚數(shù)等方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但臨床妊娠組移植后第3天E2水平顯著高于未妊娠組(P<0.05)(表2)。

表1 激素替代方案臨床妊娠與未妊娠組比較(x-±s)

注：與臨床妊娠組相比，*P<0.05

表2 自然周期方案臨床妊娠與未妊娠組比較(x-±s)

注：與臨床妊娠組相比，*P<0.05

二、移植后第3天不同E2水平FET結(jié)局比較

以移植后第3天E2水平367 pmol/L為界值分為兩組進(jìn)行比較。激素替代方案中，兩組平均年齡、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)、種植率、生化妊娠率均無(wú)顯著差異(P>0.05)；E2>367 pmol/L組的臨床妊娠率高于E2≤367 pmol/L組，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)(表3)。

自然周期方案中，兩組平均年齡、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)等均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。E2>367 pmol/L組的種植率、臨床妊娠率高于E2≤367 pmol/L組，而生化妊娠率低于E2≤367 pmol/L組，差異有顯著性(P<0.05)(表4)。

表3 激素替代方案移植后第3天不同E2水平FET結(jié)局[(x-±s)，%]

表4 自然周期方案移植后第3天不同E2水平FET結(jié)局[(x-±s)，%]

注：與E2≤367 pmol/L組相比，*P<0.05

討 論

既往研究常常關(guān)注內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日、移植日這一種植窗開(kāi)啟前期雌、孕激素水平對(duì)妊娠率的影響，而針對(duì)于移植后第3天，即種植窗即將關(guān)閉、黃體中期時(shí)雌、孕激素水平的研究較少。本文著重于研究移植后第3天的雌孕激素水平能否預(yù)測(cè)胚胎種植率和妊娠率，監(jiān)測(cè)移植后第3天的雌孕激素水平是否有意義，具有一定的創(chuàng)新性。

影響FET結(jié)局主要因素有內(nèi)膜和胚胎兩個(gè)方面。有研究認(rèn)為內(nèi)膜厚度在8 mm以上，移植優(yōu)胚數(shù)較高，妊娠率增加[2]。本研究中，激素替代方案的妊娠組與未妊娠組內(nèi)膜厚度、雌孕激素水平無(wú)顯著差異，但移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)顯著高于未妊娠組，提示胚胎因素可能是影響兩組結(jié)局的主要原因；但是在自然周期中，妊娠組與未妊娠組移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)胚數(shù)、內(nèi)膜厚度無(wú)顯著差異，妊娠組移植后第3天雌激素水平顯著高于未妊娠組，提示激素水平可能是影響兩組結(jié)局的主要原因。

卵泡期時(shí)，E2可促進(jìn)內(nèi)膜增殖，那么在內(nèi)膜準(zhǔn)備過(guò)程中，是否需監(jiān)測(cè)E2以調(diào)整用藥？圍種植期的E2濃度是否與妊娠率相關(guān)？Ma等[3]對(duì)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素過(guò)高或過(guò)低均可能影響胚胎種植，較低雌激素水平會(huì)延長(zhǎng)種植窗時(shí)間，而高雌激素水平會(huì)促進(jìn)種植窗的關(guān)閉。但也有研究認(rèn)為，調(diào)控人類種植窗的雌激素濃度范圍較廣，血清E2為50 pg/ml(183 pmol/L)時(shí)就足以開(kāi)啟和維持種植窗，它對(duì)內(nèi)膜更像是一種允許作用而非劑量調(diào)節(jié)作用[7]。項(xiàng)云改等[4]研究發(fā)現(xiàn)，移植日E2<734 pmol/L組與>734 pmol/L組間妊娠率無(wú)顯著差異；牛志宏等[5]發(fā)現(xiàn)在激素替代周期方案中，轉(zhuǎn)化日E2濃度小于495.4 pmol/L與高于495.4 pmol/L，妊娠率同樣不受影響。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是激素替代周期還是自然周期，妊娠組和未妊娠組移植日的E2水平并無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，在內(nèi)膜準(zhǔn)備過(guò)程中，監(jiān)測(cè)E2濃度似乎并無(wú)意義。

移植后第3天是黃體成熟、孕激素分泌達(dá)到高峰、雌激素分泌達(dá)到第二高峰的時(shí)期。此時(shí)較低的雌激素水平是否會(huì)影響種植率和妊娠率？一些研究認(rèn)為，在新鮮移植周期中，黃體期E2水平大幅下降不利于胚胎種植[8-10]。那么，在凍胚移植周期中，黃體期E2是否會(huì)影響妊娠率？本研究發(fā)現(xiàn)，自然周期方案中，未妊娠組移植后第3天E2水平顯著低于妊娠組。此外，移植后第3天E2≤367 pmol/L的患者和>367 pmol/L的患者相比，種植率和臨床妊娠率顯著降低，生化妊娠率顯著上升；在激素替代方案中，妊娠組與未妊娠組移植后第3天E2水平無(wú)顯著差異。以367 pmol/L為界值，兩組妊娠率和種植率無(wú)顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn)，孕激素受體(PR)的合成需要適量的雌激素。E2水平過(guò)低會(huì)導(dǎo)致PR合成不足，進(jìn)而造成黃體功能下降，影響胚胎種植[11]。自然周期中，黃體期雌、孕激素的水平由自身黃體決定，不受外源性激素影響。移植后第3天的E2水平下降可能預(yù)示黃體功能不足，胚胎種植率下降，進(jìn)而導(dǎo)致臨床妊娠率下降。而激素替代周期在移植前后均給予大量外源性雌激素，推測(cè)移植后第3天較低的血清E2水平不一定代表體內(nèi)真實(shí)的雌激素狀態(tài)，因此對(duì)預(yù)測(cè)妊娠率和種植率的意義不大。但本研究樣本量較小，移植后第3天E2水平在自然周期凍胚移植中的意義以及移植后補(bǔ)充雌激素的必要性還需進(jìn)一步的大樣本、隨機(jī)對(duì)照研究。

雌/孕激素達(dá)到怎樣的比例才能更有利于胚胎種植？這一問(wèn)題報(bào)道不一。有學(xué)者認(rèn)為在新鮮移植周期中P/E2值在300～400間妊娠率較高[12]；也有研究認(rèn)為，黃體早期，P值適當(dāng)升高有利于妊娠，而P過(guò)高，E2下降，即較高比值的P/E2對(duì)妊娠不利[13]。王麗娜等[14]對(duì)自然周期凍融胚胎移植的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組移植后第3天P/E2顯著低于未妊娠組；同樣是FET周期，宋瑞芳等[15]卻發(fā)現(xiàn)，臨床妊娠組與活產(chǎn)組P/E2比值分別高于非妊娠組和未活產(chǎn)組。本研究中，自然周期與激素替代周期中，妊娠組與未妊娠組P/E2并無(wú)顯著差異。因此，還需進(jìn)一步的大樣本研究來(lái)確定適宜胚胎種植的P/E2。

總之，移植后第3天雌激素水平可能預(yù)測(cè)自然周期凍胚移植的結(jié)局，但在激素替代周期中監(jiān)測(cè)意義不大。