何翃閎，潘陽(yáng)陽(yáng)，張慧珠，李 秦，王 萌，崔 燕，樊江峰，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

牦牛是青藏高原重要的動(dòng)物資源，是牛屬動(dòng)物中唯一對(duì)低氧環(huán)境具有強(qiáng)適應(yīng)能力的動(dòng)物[1]，其繁殖力低下，體外卵母細(xì)胞成熟率和胚胎發(fā)育能力均較低，嚴(yán)重影響其體外受精、體細(xì)胞克隆等繁殖技術(shù)的發(fā)展[2]。成熟卵母細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)體外受精具有非常重要的作用，其位于原始卵泡中，由少量鱗狀顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)包圍的小卵母細(xì)胞形成[3-5]。生殖激素與顆粒細(xì)胞相結(jié)合可促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育，如促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黃體素(luteinizing hormone, LH)等[6]。FSH是由垂體前葉的促性腺激素產(chǎn)生的糖蛋白，對(duì)體內(nèi)卵泡的生長(zhǎng)具有重要作用[7]。卵母細(xì)胞在體外成熟期間FSH可促進(jìn)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)擴(kuò)增和核成熟[8]，F(xiàn)SH還可使胚胎囊胚率和孵化囊胚率均有所增加[9]。Hiradate等[10]發(fā)現(xiàn)，SH和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)可通過MAPK依賴性途徑而調(diào)節(jié)神經(jīng)降亞素(neurotensin, NT)的表達(dá)，而NT可以充當(dāng)精子獲能的啟動(dòng)子使其在雌性生殖道中發(fā)生頂體反應(yīng)。Prochazka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PKA和MAPK14途徑對(duì)于FSH誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的反式激活起著至關(guān)重要的作用。對(duì)FSH在卵母細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮作用的研究越來越多，有研究表明，卵母細(xì)胞中FSH可改變基因的表達(dá)模式[12]，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期血清中,FSH水平較高可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的棕色透明帶厚度增加，胚胎質(zhì)量降低，妊娠率降低[13]。FSH與卵泡中EGF相互作用以激活卵母細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-磷酸/Akt級(jí)聯(lián)，以控制其翻譯和發(fā)育能力[14]。

有研究表明，牛卵母細(xì)胞早期凋亡與其發(fā)育能力有關(guān)[15]，F(xiàn)SH和EGF的協(xié)同作用可以更好地阻止豬顆粒細(xì)胞多層膜共培養(yǎng)中顆粒細(xì)胞的凋亡[16]。徐庚全等[17]研究表明，F(xiàn)SH可通過調(diào)節(jié)牦牛顆粒細(xì)胞的凋亡及分泌功能，在調(diào)控卵泡發(fā)育及排卵過程中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因伴隨X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 associated X,Bax)和B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[18]，潘陽(yáng)陽(yáng)等[2]研究表明,EGF和EGFR作為牦牛COCs體外成熟過程中重要的自分泌因子，且外源的EGF可以顯著提高卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率及囊胚率，其作用機(jī)制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax和Baxi表達(dá)有關(guān)。綜上表明，了解激素對(duì)生長(zhǎng)因子的作用以及卵母細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和附植前胚胎的發(fā)育具有重要意義，但目前在國(guó)內(nèi)外尚未見關(guān)于FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞EGF、EGFR表達(dá)及其細(xì)胞凋亡的影響方面的報(bào)道，本試驗(yàn)通過在牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，加入不同濃度的FSH，檢測(cè)卵母細(xì)胞成熟率，采用Real-time PCR、蛋白免疫印跡法和免疫熒光染色法檢測(cè)卵母細(xì)胞成熟過程中Bax和Bcl-2、EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表達(dá)動(dòng)態(tài)，以期闡明FSH與EGF與EGFR的關(guān)系，為進(jìn)一步探討FSH在牦牛生殖過程中發(fā)揮的作用以及EGF和EGFR對(duì)牦牛卵母細(xì)胞成熟和后期胚胎發(fā)育的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

促卵泡素(FSH)、EGF、雌二醇(E2)、促黃體素(LH)、透明質(zhì)酸酶以及M199 培養(yǎng)液為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清FBS購(gòu)自Hyclone公司。微量樣品總RNA提取試劑盒(Omega)、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)、SYBR Green II熒光定量PCR試劑盒(寶生物)，免疫熒光染色所用試劑購(gòu)自南京碧云天生物公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。EGF抗體(ab9862, Munich, Germany)、EGFR抗體(ab2430, Munich, Germany)、Bax抗體(ab77566， Munich, Germany)和Bcl-2抗體(ab117115, Munich, Germany)為Abcam公司產(chǎn)品，所有二抗為北京博奧森公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀(ABI ViiA7，Life technologies公司，美國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 牦牛卵巢及卵母細(xì)胞的采集

牦牛的卵巢采自青海省西寧市樂家灣屠宰場(chǎng)。將從屠宰場(chǎng)采集的牦牛卵巢置于37 ℃生理鹽水中，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，用生理鹽水清洗3遍，用帶18G 針頭注射器采集卵巢表面直徑約3～10 mm卵泡，體視顯微鏡下挑選形態(tài)完好、細(xì)胞質(zhì)均勻，周圍帶有3層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用洗卵液(DPBS+5% FBS)清洗3遍后，備用。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

配制卵母細(xì)胞成熟液(M199+10 mmol·L-1Hepes+10% FBS+1 μg·mL-1E2+1 mg·mL-1BSA)，分別加入不同濃度的FSH，使其最終濃度為0、2、5、10 μg·mL-1。將COCs隨機(jī)分為4組，分別放入含不同濃度FSH的卵母細(xì)胞成熟液中，于38 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，將部分成熟COCs進(jìn)行凍存和固定，每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)5次。

1.4 卵母細(xì)胞成熟率統(tǒng)計(jì)

在光學(xué)顯微鏡下，觀察COCs的形態(tài)，根據(jù)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張情況判斷卵母細(xì)胞的成熟。將成熟的COCs放入0.1%透明質(zhì)酸酶中，用移液槍輕微吹打5 min，以去除卵丘細(xì)胞而得到裸卵，用玻璃針撥動(dòng)其卵母細(xì)胞，根據(jù)第一極體排出來統(tǒng)計(jì)成熟卵母細(xì)胞(M II期)，每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)5次。

1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將每個(gè)試驗(yàn)組中的5個(gè)COCs用PBS清洗3次后，用微量樣品總RNA提取試劑盒提取總RNA，再用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA[19]，放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 qRT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2、EGF和EGFR基因的表達(dá)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的牛EGF(AY192564)、EGFR(HM749883)、Bax(NM173894)、Bcl-2(NM001166486)和β-actin(JF830811)的序列，用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)了5對(duì)引物(表1)，引物均由上海華大基因科技有限公司合成。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)EGF、EGFR、Bax和Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL FastStart Master SYBR Green Mix，1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5 μL，無菌去離子水 7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性4 s，60 ℃退火(EGF、EGFR、β-actin)，57 ℃(Bax)和64 ℃(Bcl-2)退火20 s，72 ℃延伸 10 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7 免疫熒光染色檢測(cè)EGF和EGFR蛋白的表達(dá)

將不同處理組的COCs用免疫染色固定液在室溫下固定1 h，然后在室溫條件下，用免疫染色洗滌液洗3次，用含0.2% TritonX-100 的免疫染色封閉液封閉1 h，將COCs置于用含2%BSA的PBS稀釋成5 μg·mL-1的一抗EGF和EGFR中(EGF和EGFR抗體分別是山羊和兔多克隆抗體)，在4 ℃孵育過夜，再用含2%BSA的PBS洗3次，先后移入含有APC標(biāo)記的驢抗山羊抗體和FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體中孵育2 h，清洗3次后，封片，再用熒光顯微鏡觀察并照相。同時(shí)，使用含有2%BSA的PBS替代陰性一抗作為對(duì)照組，其他步驟與試驗(yàn)組保持一致。

1.8 Western blotting檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

提取不同處理組的總蛋白，將其與上樣緩沖液(4×)按3∶1混合，100 ℃煮10 min，冰上5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；再用半干法將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉1.5 h(搖床振動(dòng)，70 r·min-1)，用Bax和Bcl-2的抗體4 ℃孵育過夜，用二抗室溫孵育1.5 h，每步完成后，用TBST洗膜，每次洗3遍，每遍 5 min，最后用ECL避光顯色，X 光片顯影、定影，再掃描蛋白印跡條帶。試驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)掃描的蛋白印跡條帶用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

表1目的基因和內(nèi)參基因引物序列

Table1Primersequencesoftargetandhouse-keepinggenes

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence位置/bpPosition退火溫度/℃Tm 產(chǎn)物大小/bpProduct length GenBank登錄號(hào)GenBank accession No.EGFF:GCAGTATCTTCTCACCATCAGCACR:AAAACCAGAGCCCCAAACAA706～89360188AY192564EGFRF:CTATGACCCTACCACCTACGAR:AAACTCACCGATTCCTATTCC738～94660209HM749883BaxF:TTTGCTTCAGGGTTTCATCR:CAGCTGCGATCATCCTCT75～24857174NM173894Bcl-2F:CTGCACCTGACGCCCTTCACR:GCGTCCCAGCCTCCGTTGT325～56064236NM001166486β-actinF:CTTCAACACCCCTGCCATR:CTCGGCTGTGGTGGTGAAG38～27560238JF830811

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析不同COCs組卵母細(xì)胞中EGF、EGFR、Bax和Bcl-2 mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，成熟率以卵母細(xì)胞數(shù)為基數(shù)進(jìn)行比較，每組至少3次重復(fù)。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞成熟率的影響

根據(jù)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散(圖1)和第一極體(圖2)來判斷卵母細(xì)胞的成熟情況，隨著卵母細(xì)胞的成熟，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散越明顯(圖1)，成熟卵母細(xì)胞的第一極體為圓形，胞質(zhì)均質(zhì)，膜表面平滑完整(圖2)。消化卵丘細(xì)胞后，根據(jù)成熟卵母細(xì)胞排出第一極體來統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞的成熟率(表2)，發(fā)現(xiàn)成熟培養(yǎng)液中加入FSH均可提高COCs的成熟率，當(dāng)成熟液中加FSH為5 μg·mL-1時(shí)成熟率最高，達(dá)到76.84%，其顯著高于其他組(P<0.05)； 2和 10 μg·mL-1FSH組成熟率分別為67.41% 和 57.23%；無FSH(0 μg·mL-1)陰性對(duì)照組的成熟率最低，為51.97%。10 μg·mL-1FSH組與無FSH(0 μg·mL-1)陰性對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)，而其他組別之間均差異顯著(P<0.05)。

2.2 FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞中EGF和EGFR mRNA水平的影響

通過實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)EGF和EGFR的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析表明(圖3)，在 0、2和5 μg·mL-1FSH組中，隨著FSH濃度增加，EGF和EGFR表達(dá)量逐漸升高；然而，在10 μg·mL-1FSH組中，EGF和EGFR的表達(dá)水平降低，其中在5 μg·mL-1FSH組中，EGF和EGFR的表達(dá)均顯著高于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)。

2.3 FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞中Bax和Bcl-2 mRNA水平的調(diào)節(jié)

通過實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析表明(圖4)，在2和5 μg·mL-1FSH組中，Bax和Bcl-2的表達(dá)顯示明顯的逆向模式，Bcl-2的表達(dá)水平逐漸升高，Bax的表達(dá)水平逐漸降低。5 μg·mL-1FSH組Bax的表達(dá)量最低，其顯著低于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)量最高，其顯著高于0、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)。2 μg·mL-1FSH組中Bax的表達(dá)水平低于0和10 μg·mL-1FSH組，Bcl-2在2 μg·mL-1FSH組中的表達(dá)均比0和10 μg·mL-1FSH組高。

A.未成熟的卵母細(xì)胞； B.陰性對(duì)照卵母細(xì)胞(FSH 0 μg·mL-1)；C.2 μg·mL-1 FSH；D.5 μg·mL-1 FSH；E.10 μg·mL-1 FSHA.Immature oocytes; B.The negative control oocytes (0 μg·mL-1 FSH); C. 2 μg·mL-1 FSH；D. 5 μg·mL-1 FSH；E. 10 μg·mL-1 FSH圖1 牦牛未成熟的卵母細(xì)胞和4種不同濃度FSH處理24 h后的成熟卵母細(xì)胞(200×,標(biāo)尺50 μm)Fig.1 Development of yak oocytes in vitro with 4 different FSH concentrations for 24 h and immaturate oocytes (200×,Bar 50 μm)

A.成熟卵母細(xì)胞；B.未成熟卵母細(xì)胞。.第一極體A. Mature oocytes; B.Immature oocytes. .The first polarbody圖2 根據(jù)第一極體判斷卵母細(xì)胞的成熟(200×，標(biāo)尺 50 μm)Fig.2 The maturation of oocytes were assessed based on first polar body (200×,Bar 50 μm)

表2不同濃度FSH對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響

Table2RatesofmatureyakoocytesafteradditionofFSHwithvariousconcentrations

FSH濃度/(μg·mL-1)FSH concentration 卵母細(xì)胞數(shù)(重復(fù)次數(shù))Number of oocytes (replicates)卵母細(xì)胞的成熟率/%Rate of mature yak oocytes061(3)51.97±4.83a276(3)67.41±2.16c542(3)76.84±5.32b1060(3)57.23±3.49a

同一列中不同字母表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05)

Different superscripts(a, b, c) indicate the significant difference among different concentration groups (P<0.05)

誤差線上不同的字母表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05);相同的字母表示不同濃度組間差異不顯著(P>0.05)。下同Bars with different superscripts mean significant difference among different concentration groups (P<0.05); Bars with same superscripts mean no significant difference among different concentration groups (P>0.05). The same as below圖3 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛卵母細(xì)胞EGF和EGFR的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative abundance of EGF and EGFR mRNA in yak oocytes with different concentrations of FSH

2.4 EGF和EGFR在牦牛COCs中的分布檢測(cè)

對(duì)EGF和EGFR蛋白分別用藍(lán)色和綠色進(jìn)行熒光染色(圖5)。FSH濃度較低時(shí)，EGF和EGFR的熒光強(qiáng)度較低，卵丘細(xì)胞擴(kuò)增不完整(圖5 A1，圖5 A2, 圖5 B1和圖5B2)隨著FSH濃度增加時(shí)，EGF和EGFR的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，其中5 μg·mL-1FSH組中EGF和EGFR表達(dá)水平最高，并且卵丘細(xì)胞的擴(kuò)增比其他組的細(xì)胞擴(kuò)增完整(圖5 C1和圖5 C2)，但當(dāng)FSH濃度增加到10 μg·mL-1時(shí)，而熒光強(qiáng)度降低(圖5 D1，圖5 D2)。通過免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EGF主要位于卵丘細(xì)胞中，而EGFR在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均可檢測(cè)到(圖5)。

圖4 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛卵母細(xì)胞Bax和Bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative abundance of Bax and Bcl-2 mRNA in yak oocytes with different concentrations of FSH

圖5 不同濃度FSH的成熟液處理后牦牛COCs中EGF、EGFR蛋白分布(200×)Fig.5 The distribution of EGF and EGFR proteins in yak COCs with different concentrations of FSH(200×)

2.5 FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blotting方法檢測(cè),添加FSH顯著增加了牦牛COCs中抗凋亡分子Bcl-2蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)也明顯降低了牦牛COCs中促凋亡分子Bax蛋白水平的表達(dá)(10 μg·mol-1FSH組除外)(圖6A)。在5 μg·mL-1FSH組中Bax表達(dá)量最低，其顯著低于0 (陰性對(duì)照)、2和10 μg·mL-1FSH組(P<0.05)，而在10 μg·mL-1FSH組中Bax表達(dá)量最高(圖6B)；Bcl-2蛋白在5與10 μg·mL-1FSH組中相比其表達(dá)量接近，其差異性不顯著(P>0.05)(圖6B)。

圖6 Western blotting檢測(cè)(A)及不同組Bax和Bcl-2蛋白水平的表達(dá)(B)Fig.6 Detected the expression levels (B) of Bax and Bcl-2 proteins by Western blotting(A) in different groups

3 討 論

了解生殖激素對(duì)成熟卵母細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用對(duì)于開發(fā)有效的體外成熟(IVM)體系是非常重要的。本研究探討了FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞IVM的特異性作用及其對(duì)EGF、EGFR、Bax和Bcl-2等生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)因子的作用。EGFR的特異性抑制劑tyrphostin AG 1478有效阻斷FSH誘導(dǎo)的豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，表明EGFR或EGF受體信號(hào)通路與FSH的作用有關(guān)[20]。此外，EGF和FSH對(duì)豬卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟具有協(xié)同作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH提高了牦牛COCs中細(xì)胞核的成熟率(表2)，并且在體外條件下，誘導(dǎo)了牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中EGF和EGFR的表達(dá)(圖3和圖5)，而且其與FSH的濃度有關(guān)；當(dāng)FSH為5 μg·mL-1時(shí)，卵母細(xì)胞中EGF和EGFR水平最高，卵母細(xì)胞成熟率最高，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)增比其他各組均完整(圖1和圖5)，但當(dāng)FSH為10 μg·mL-1時(shí)，卵母細(xì)胞成熟率及EGF、EGFR、Bcl-2表達(dá)均下降(表2，圖6)，而Bax增強(qiáng)(圖4和6)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中FSH的最適濃度為5 μg·mL-1。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)SH誘導(dǎo)牦牛卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張(圖1和圖5)。前人研究表明，F(xiàn)SH在卵母細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用[22]，其可以增強(qiáng)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張[23]，這與本研究相一致；EGF和EGFR在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中受FSH的誘導(dǎo)表達(dá)，并且牦牛卵丘細(xì)胞的增殖與其表達(dá)水平一致。FSH主要通過激活cAMP依賴性信號(hào)通路后激活其周圍卵丘細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)[24]，卵泡發(fā)生～早期竇性階段被認(rèn)為FSH是獨(dú)立的，而竇性(晚期)卵泡發(fā)生完全依賴FSH[25]，但是，cAMP不能直接激活MAPK[26]，cAMP激活MAPK的具體過程尚未完全了解。FSH通過p38 MAPK誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)絲氨酸727去磷酸化作用可以下調(diào)細(xì)胞色素P450 1B1(cytochrome P450 B1, Cyp1b1)表達(dá)并維持小鼠優(yōu)勢(shì)卵泡中的雌二醇水平[27]，F(xiàn)SH和17β-雌二醇聯(lián)合作用時(shí)，通過cAMP、Ca2+內(nèi)流和ERK1/2途徑參與了FSH和17β-雌二醇對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA和細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)[28]。蛋白激酶A II(protein kinase A II, PKAII)和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是FSH通過MAPK激活而起作用的可能途徑[29]。綜上，EGF和EGFR在FSH誘導(dǎo)的牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。然而，在大多數(shù)組中EGFR的表達(dá)水平高于EGF(圖3)，這可能是由許多激活EGFR配體引起的，包括EGF、TGFα、雙調(diào)蛋白(Ar)、肝素結(jié)合的EGF(HB-EGF)和鈣結(jié)合蛋白-D9k(CaBP-9k)等[30-31]。因此，F(xiàn)SH對(duì)COCs分泌EGFR配體的影響不容忽視，本研究用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的EGF和EGFR在牦牛COCs中具有特異性的表達(dá)，其在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均可檢測(cè)到EGFR，而EGF僅在卵丘細(xì)胞上檢測(cè)到(圖5)，這與卵丘細(xì)胞的存在對(duì)于EGF作用是必需的[21]研究相一致。

卵母細(xì)胞質(zhì)量是決定胚胎發(fā)育的最重要參數(shù)，結(jié)合COCs的形態(tài)學(xué)研究凋亡基因的表達(dá)是判斷COCs質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究在卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)張組中Bcl-2基因表達(dá)量最高，而Bax表達(dá)最低，同時(shí)卵母細(xì)胞的成熟率也最高，這表明FSH通過調(diào)控Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了卵母細(xì)胞凋亡。有研究表明，Bax和Bcl-2表達(dá)與體外培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量有關(guān)[18]，Bax與Bcl-2的比率可以用來測(cè)量卵母細(xì)胞和胚胎存活或凋亡的趨勢(shì)。然而，調(diào)控卵母細(xì)胞質(zhì)量并影響卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的細(xì)胞凋亡基因很多[32]，F(xiàn)SH在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過程中是否誘導(dǎo)其他凋亡基因尚不清楚。

本研究FSH誘導(dǎo)EGF、EGFR和Bcl-2表達(dá)趨勢(shì)在牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育過程是一致的，而Bax的表達(dá)恰恰與其相反。Kawamura等[33]研究表明，EGF作為自分泌/旁分泌的生長(zhǎng)因子可促進(jìn)人早期胚胎發(fā)育，EGF對(duì)凋亡相關(guān)基因是可以進(jìn)行調(diào)控的[34]。本研究結(jié)果表明，在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中，F(xiàn)SH可調(diào)節(jié)EGF、EGFR、Bcl-2和Bax的表達(dá)。因此，推測(cè)EGF、EGFR、Bcl-2和Bax在FSH誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟和抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用，但Bax和Bcl-2變化是否受FSH誘導(dǎo)的EGF和EGFR調(diào)節(jié)，以及FSH信號(hào)傳導(dǎo)通路與EGF、EGFR、Bax和Bcl-2的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在牦牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中，F(xiàn)SH提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力并誘導(dǎo)EGF和EGFR表達(dá)，而且通過調(diào)控Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，抑制卵母細(xì)胞凋亡，推測(cè)EGF、EGFR、Bcl-2和Bax在FSH誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟和抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用，為進(jìn)一步探討FSH在牦牛生殖過程中發(fā)揮的作用以及EGF和EGFR對(duì)牦牛卵母細(xì)胞成熟和后期胚胎發(fā)育的影響提供理論依據(jù)。