楊婧 孟慶華

100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病重癥醫(yī)學(xué)科

全球約有20億人曾感染過HBV，其中2.48億為慢乙肝感染者，每年大約有100萬人死于HBV相關(guān)性肝硬化和肝癌。我國在2006年一項HBV血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示1～59歲的HBsAg陽性率為7.18%，約有9 000萬人是HBV慢性感染者［1］。有研究證實，50% ～80%的肝癌病例與HBV密切相關(guān)［2］。2012年EASL臨床實踐指南提到當(dāng)肝硬化明確時，肝癌年發(fā)病率為2% ～5%。HBV感染是我國肝癌的首要危險因素。

20世紀(jì)20年代Atto Warburg提出了代謝重編程理論，該理論認(rèn)為腫瘤細(xì)胞生長在缺氧的微環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)升高進(jìn)而誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運體 1（Glucose transporter 1，GLUT1）高表達(dá)，增加葡萄糖的攝入，上調(diào)丙酮酸激酶 2（pyruvate kinase M2，PKM2）等有氧糖酵解途徑的多個關(guān)鍵酶，從而產(chǎn)生大量終產(chǎn)物乳酸。

近年來有研究顯示，腫瘤細(xì)胞代謝存在著有氧糖酵解及代謝共生兩種方式［3］?！坝醒跆墙徒狻碑a(chǎn)生的乳酸由缺氧區(qū)細(xì)胞經(jīng)單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4（monocarboxylic acid transporter4， MCT4）外排，又經(jīng)MCT1被富氧區(qū)細(xì)胞攝取，進(jìn)而通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。因此，MCT1／4共表達(dá)于腫瘤組織也被認(rèn)為是腫瘤代謝共生的生物標(biāo)志［4］。有文獻(xiàn)證實，眾多腫瘤均存在代謝共生現(xiàn)象［5-9］。

本研究對10例HBV相關(guān)的原發(fā)性肝癌患者的肝癌及癌旁組織進(jìn)行免疫組化，檢測其組織代謝指標(biāo)、臨床生化及病毒學(xué)指標(biāo)；選取肝癌HLE細(xì)胞通過不同缺氧時間、不同環(huán)境氧濃度培養(yǎng)，模擬實體腫瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境，其目的是了解肝癌在缺氧環(huán)境中有氧糖酵解和代謝共生狀況，為臨床精準(zhǔn)干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究對象入組標(biāo)準(zhǔn)10例標(biāo)本均為2016—2017年間于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝膽外科接受肝占位性病變根治性切除，并經(jīng)組織病理學(xué)證實的原發(fā)性肝癌；患者術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，未接受放化療，無手術(shù)史；標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋包括腫瘤組織及癌旁組織；10例患者有完整的臨床資料，包括性別、年齡、肝炎史、術(shù)前 AFP、ALT、TBil、ALB、PLT、PTA、Child分級等。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 非乙型肝炎病毒感染者；肝轉(zhuǎn)移癌；合并膽管癌、胃癌等其他腫瘤；妊娠女性。

1.3 材料與試劑 HRP山羊抗兔鼠通用二抗（DAKO，丹麥）；組化試劑盒 DAB 顯色劑（DAKO，丹麥）；無水乙醇（國藥，上海）；二甲苯（國藥，上海）；BSA（索萊寶公司，北京）；肝癌細(xì)胞株（HLE細(xì)胞株）由北京市肝病研究所提供；正常肝細(xì)胞株（L02細(xì)胞株）由北京市肝病研究所提供；DMEM培養(yǎng)基（HyClone，美國）；胎牛血清（四季青公司，杭州）；青霉素、鏈霉素雙抗（索萊寶公司，北京）；β-actin抗體（CST 公司，美國，4970S）；HIF-1α（WB 工作濃度 1∶1000，購自 Abcam 公司，Ab187524）、GLUT1（WB 工作濃度 1∶1000，購自 Abcam 公司，Ab652）、PKM2（WB工作濃度 1∶1000，購自 Abcam公司，Ab150377）、抗MCT1兔抗人多抗抗體（IHC工作濃度1∶200，WB 工作濃度 1∶1000，購自 Abcam 公司，Ab85021）、抗MCT4兔抗人多抗抗體（IHC工作濃度1∶100，WB 工作濃度 1∶1000，購自 Abcam 公司，Ab180699）；羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶（WB工作濃度 1∶1000，碧云天公司，A0208）；PVDF 膜（Millipore公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：①石蠟切片脫蠟及水化。②抗原修復(fù)：EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）中微波修復(fù)。冷卻后PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5 min。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，PBS（pH7.4）洗滌 3 次，每次 5 min。 ④BSA封閉：3%BSA，室溫封閉30 min。⑤加一抗：滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。⑥加二抗：滴加二抗，室溫孵育50 min。PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。⑦DAB顯色：滴加新鮮配制的DAB顯色液，陽性為棕黃色。⑧復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染，1%的鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。⑨脫水封片：脫水后中性樹膠封片。⑩顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)：使用10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，應(yīng)用含有10%胎牛血清、100μg／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h～28 h傳代1次。

1.3.4 缺氧培養(yǎng)HLE細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的HLE細(xì)胞更換為無血清的基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液，并同時放入Binder三氣培養(yǎng)箱內(nèi)，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h。正常對照組HLE細(xì)胞不作任何處理，相同條件培養(yǎng)。

1.3.5 環(huán)境氧濃度對HLE細(xì)胞代謝的影響：將處于對數(shù)生長期的HLE細(xì)胞更換為無血清的基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液，并同時放入Binder三氣培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在0.2%、8%、19%氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)12 h。正常對照組HLE細(xì)胞、L02細(xì)胞不作任何處理，在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 10例HBV相關(guān)HCC患者基本資料Tab.1 Basic information of 10 patients with HBV-related HCC

1.3.6 Western blot檢測 HLE 細(xì)胞 HIF-1α、GLUT1、PKM2、MCT1、MCT4蛋白表達(dá)：收集正常對照組和上述不同缺氧處理組的培養(yǎng)細(xì)胞，分別用1 ml預(yù)冷的PBS清洗3次，立即收集細(xì)胞；冰上提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；取30μg的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗（1∶1000）4℃過夜孵育，1xTBST洗膜3次，每次10 min；二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，1xTBST 洗膜3次，每次20 min。曝光，顯影并定影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 10例HBV相關(guān)肝癌患者均為男性，平均年齡52.8歲（37～62歲），其中Child A級患者7例，Child B級患者3例。10例患者AFP（5836.15 ± 13633.06 ng／ml）、ALT（52.58 ± 41.27 U／L）、TBil（17.81 ± 6.96 μmol／L）、ALB（37.87 ±5.01 g／L）、PLT （116.70 ± 63.10 × 109／L）、PTA（86.70±11.24%）。乙肝兩對半檢測結(jié)果顯示，編號2患者HBsAg陽性、e抗原陽性、e抗體陽性、核心抗體陽性。編號10患者HBsAg陽性、核心抗體陽性。其余8例患者均為HBsAg陽性、e抗體陽性、核心抗體陽性。HBV DNA定量見表1所示。免疫組化檢測結(jié)果顯示，肝癌較癌旁組織MCT1表達(dá)升高，但MCT4無明顯改變，見表1、圖1。

圖1 免疫組化檢測肝癌及癌旁組織中MCT1、MCT4表達(dá)Note： a.MCT1 expression n liver cancer tissues； b.MCT1 expression in adjacent tissues；c.MCT4 expression in liver cancer tissues；d.MCT4 expression in adjacent tissuesFig.1 Immunohistochemical detection of MCT1 and MCT4 expression in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues

2.2 缺氧時間對HLE細(xì)胞HIF-1α的影響 在0.2%的氧濃度時，缺氧6 h，HLE細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增加，在缺氧培養(yǎng)12 h時，HIF-1α達(dá)到表達(dá)高峰（P＜0.05），之后表達(dá)量下降，見圖2。

圖2 HLE細(xì)胞HIF-1α表達(dá)Fig.2 Expression of HIF-1αin HLE cells

圖3 HLE 細(xì)胞 HIF-1α、GLUT1、PKM2 表達(dá)Fig.3 Expression of HIF-1α， GLUT1 and PKM2 in HLE cells

圖4 HLE細(xì)胞MCT1、MCT4表達(dá)Fig.4 Expression of MCT1、MCT4 in HLE cells

2.3 環(huán)境氧濃度梯度對HLE細(xì)胞HIF-1α及代謝的影響 如圖3所示，分別在0.2%、8%、19%氧濃度環(huán)境中，發(fā)現(xiàn) HIF-1α、GLUT1在環(huán)境氧濃度為0.2%時表達(dá)較正常對照組以及其他氧濃度組顯著性升高（P＜0.05），PKM2在環(huán)境氧濃度為8%時表達(dá)明顯高于正常對照組以及其他氧濃度組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

如圖4所示，代謝共生標(biāo)志物MCT4在環(huán)境氧濃度為19%時，表達(dá)明顯高于正常對照組及其他氧濃度組（P＜0.05），MCT1在環(huán)境氧濃度為19%時表達(dá)較正常對照組（L02）低，但明顯高于其他環(huán)境氧濃度下HLE細(xì)胞各組（P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)MCT1主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，HBV相關(guān)肝癌組織中MCT1表達(dá)明顯高于癌旁組織，但MCT4在癌及癌旁組織的細(xì)胞膜上表達(dá)并無明顯差異，這一結(jié)果與此前在乳腺癌、結(jié)直腸癌中的研究結(jié)果一致［10-11］。代謝共生理論認(rèn)為，有氧糖酵解產(chǎn)生的乳酸可經(jīng)MCT4排出后被MCT1攝取，在乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸，本課題中肝癌組織較癌旁組織MCT1高表達(dá)，盡管沒有統(tǒng)計學(xué)差異但提示肝癌組織存在著較高水平攝取乳酸的能力，它很可能將攝取的乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，從而實現(xiàn)代謝共生。為此，本研究進(jìn)一步在細(xì)胞水平對肝癌細(xì)胞的代謝進(jìn)行研究。

本研究利用不同缺氧時間、不同環(huán)境氧濃度兩種處理，對肝癌HLE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，HIF-1α的表達(dá)在氧濃度為0.2%，缺氧培養(yǎng)12 h時顯著性升高。在0.2%氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)12 h，HIF-1α、GLUT 1表達(dá)較其他組顯著性升高，說明缺氧刺激HLE細(xì)胞上調(diào)HIF-1α、GLUT1的表達(dá)，增加葡萄糖的攝?。籔KM2的表達(dá)在氧濃度為0.2%時增加，氧濃度為8%時達(dá)高峰，表明近似無氧的條件下HLE細(xì)胞發(fā)生了有氧糖酵解，隨著氧濃度逐漸升高至8%，有氧糖酵解的發(fā)生也達(dá)到高峰。HIF-1α是細(xì)胞應(yīng)對缺氧的感受器以及重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以上調(diào)GLUT1、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、LDH和MCT4等，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝。低氧環(huán)境和HRE／HIF-1α結(jié)合的復(fù)合物雙重調(diào)控可使GLUT1表達(dá)增高，增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運。本研究中HIF-1α、GLUT 1與PKM2的表達(dá)在氧濃度為0.2%和8%時出現(xiàn)分離現(xiàn)象，可能由于有氧糖酵解的中間代謝產(chǎn)物可以通過磷酸戊糖、氨基酸及脂質(zhì)合成等途徑進(jìn)行生物合成代謝，為腫瘤提供蛋白質(zhì)、脂肪及核酸，而脂肪酸和氨基酸的氧化代謝也可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ATP供能。因此，葡萄糖并非腫瘤細(xì)胞的唯一供能來源［12-13］。

以正常培養(yǎng)的L02細(xì)胞作為另一組對照，我們進(jìn)一步檢測了腫瘤代謝共生標(biāo)志物MCT1／4。HLE細(xì)胞在氧濃度為0.2%的缺氧條件下以及氧濃度為19%近似于常氧條件下高表達(dá)MCT4，在氧濃度為19%近似于常氧條件下高表達(dá)MCT1，這說明氧濃度水平對MCT1／4的表達(dá)存在調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞代謝。當(dāng)環(huán)境氧濃度為19%時HLE細(xì)胞MCT1／4表達(dá)最高，此時有氧糖酵解關(guān)鍵酶PKM2并未隨著MCT1／4升高而表達(dá)增加。這從側(cè)面說明了PKM2在缺氧時參與了有氧糖酵解，而在近于常氧條件下乳酸轉(zhuǎn)運頻繁，肝癌HLE細(xì)胞優(yōu)先進(jìn)行代謝共生而不是有氧糖酵解。值得注意的是，HLE細(xì)胞MCT1在氧濃度為0.2%時與正常培養(yǎng)時表達(dá)量無明顯差異，這可能是由于正常培養(yǎng)時給予了HLE細(xì)胞充足的營養(yǎng)，供其抵抗能量消耗，因此MCT1沒有代償性升高，而氧濃度為0.2%時細(xì)胞處于幾乎無氧的條件下，不僅影響腫瘤細(xì)胞的功能，也影響其對異常代謝的代償能力。

本研究結(jié)果可以見到：HBV相關(guān)肝癌組織存在能量代謝異常；在近似于無氧環(huán)境或近似于常氧環(huán)境中，肝癌HLE細(xì)胞株并未優(yōu)先選擇有氧糖酵解；在缺氧環(huán)境中，有氧糖酵解發(fā)生時并發(fā)代謝共生。提示我們不能僅僅局限于有氧糖酵解，代謝共生相關(guān)分子也可能存在著治療腫瘤的特異性靶點，通過阻斷腫瘤代謝促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而可以達(dá)到治療腫瘤的目的。