陳孫云 郭春輝 吳楠楠 王蓓 鄧國(guó)炯

214400江陰，東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院（陳孫云、郭春輝、鄧國(guó)炯）；210009南京，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（吳楠楠、王蓓）

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）能有效降低艾滋病病毒（HIV）感染相關(guān)的疾病的患病率和死亡率，極大降低了HIV的感染率，提高了HIV感染者的生活質(zhì)量［1-3］，而HIV的易突變特性加之抗病毒治療藥物的選擇壓力最終導(dǎo)致了耐藥的發(fā)生，嚴(yán)重影響著HIV感染者抗病毒治療的效果以及生存問題，受到了全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的極大關(guān)注。目前在我國(guó)對(duì)于HIV-1感染者在感染后／治療前都未進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，因此對(duì)新發(fā)感染者耐藥位點(diǎn)的早期監(jiān)測(cè)，及時(shí)調(diào)整患者治療方案，對(duì)減少耐藥產(chǎn)生及提高抗病毒治療效果意義重大。為進(jìn)一步了解江陰市2013—2015年常住人口中新發(fā)HIV-1感染者亞型分布及原發(fā)耐藥基因變異情況，現(xiàn)對(duì)該人群進(jìn)行耐藥性檢測(cè)與分型，以更清楚地了解當(dāng)?shù)豀IV-1亞型流行及耐藥突變狀況，為HIV-1感染者的耐藥檢測(cè)和后續(xù)治療提供依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

表1 HIV-1 pol基因擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences and fragments length of HIV-1 pol

1.1 樣本來源 選取江蘇省江陰市疾病預(yù)防控制中心2013—2015年確認(rèn)和管理的111例新發(fā)HIV-1感染者為研究對(duì)象，研究對(duì)象均為當(dāng)?shù)爻Ｗ∪丝?。在取得研究?duì)象的知情同意的情況下，開展流行病學(xué)調(diào)查研究，并進(jìn)行2～4年隨訪調(diào)查。采集患者外周靜脈血，在6 h內(nèi)進(jìn)行血漿、血細(xì)胞的分離后置于-80℃冷藏備用。

1.2 核酸提取與基因擴(kuò)增 用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen公司）試劑盒從外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取前病毒DNA，使用TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version試劑對(duì)HIV-1的pol區(qū)基因進(jìn)行巢式PCR法擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：第1輪 98℃ 3 min；98℃30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。 第2輪 98 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)體系為：H2O 34.5 μmol／L，10 × Ex Taq Buffer 5 μmol／L，dNTP Mixture（2.5 mmol／L）4 μmol／L，上下引物（20 μmol／L）各 0.5 μmol／L，Ex Taq HS0.5 μmol／L。 引物序列見表1。以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳鑒定無誤后，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為第二輪擴(kuò)增引物。

1.3 序列分析 對(duì)測(cè)序公司返回的序列通過Contig Express進(jìn)行拼接與堿基的校正，使用BioEdit 7.0軟件生成“fasta文件”數(shù)據(jù)庫(kù)并提交至 https：／／www.hiv.lanl.gov／content／sequence／BASIC＿BLAST／basic＿blast.html中的HIV BLAST程序，進(jìn)行快速分型并下載相似度最高的序列作為參考序列。使用Mega 6.06構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Phylogenetic tree），確定樣本分型。再將序列提交至斯坦福大學(xué)HIV耐藥 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （ http：／／hivdb.stanford.edu／pages／algs／sierra＿sequence.html）進(jìn)行耐藥突變位點(diǎn)分析。每個(gè)耐藥突變位點(diǎn)有其相對(duì)應(yīng)的對(duì)某個(gè)藥物的耐藥分值：潛在低度耐藥（P-L）：10 ～14 分，低度耐藥（L）：15～29分，中度耐藥（I）：30～59分，高度耐藥（H）：≥60分。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本研究共納入HIV-1感染者111例，以男性為主（90.1%）；年齡 33～54歲居多（65.7%）；婚姻以已婚有配偶較多，占41.4%；文化程度初中、高中或中專居多，占58.5%；傳播途徑以同性性傳播為主（70.3%），見表2。

表2 111例HIV-1感染者基本人口學(xué)特征Tab.2 Basic demographic characteristics of 111 HIV-1 infected patients

2.2 病毒亞型分析 111份樣本經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增100例。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，CRF01＿AE（44／100）、CRF07＿BC（21／100）以及 CRF67＿01B（14／100）亞型為主要亞型。 CRF67＿01B、CRF01＿AE、B 亞型以同性性傳播為主，CRF07＿BC亞型中傳播方式最為復(fù)雜，其中2例為注射毒品傳播，CRF08＿BC亞型中均通過異性性傳播感染（見圖1）。

2.3 基因型耐藥基因突變位點(diǎn)情況 參照WHO推薦的耐藥突變位點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，14例HIV-1感染者存在基因型耐藥突變，耐藥率為14.0%（14／100）。核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制（NNRTIs）以及蛋白酶抑制劑（PIs）耐藥突變率分別為3.0%、7.0%、6.0%。NRTIs耐藥突變位點(diǎn)有 T215 A／D、M184 V／I和 K219Q，其中 T215 A／D突變可致AZT類藥物低度耐藥，M184I可致ABC低度耐藥、FTC／3TC高度耐藥；NNRTIs耐藥突變位點(diǎn)有 Y181C、G190 A、V179D、K238 N、H221Y 和M230I，其中 Y181C聯(lián)合 G190 A耐藥突變可致EFV／NVP／RPV高度耐藥；PIs耐藥突變位點(diǎn)有M46 L、N83D、L33F和 L10F，M46 L與 L10F 聯(lián)合突變可致NFV中度耐藥（表3）。

圖1 江陰市100例HIV-1感染者pol基因進(jìn)化樹分析Note：Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by Mega 6.06 and the bootstrap value was 1000.Red dots for branch bootstrap values greater than 75%were marked in the picture.The scale representing the distance of genes，was marked at the lower right of the treeFig.1 Phylogenetic tree of HIV-1 pol gene of 100 samples from Jiangyin

2.4 臨床治療耐藥隨訪情況 對(duì)111例患者進(jìn)行為期2～4年隨訪調(diào)查，結(jié)果顯示14例基因型耐藥患者有9例患者在治療過程中發(fā)生了臨床耐藥（表3），耐藥率為 8.1%（9／111）。 隨訪調(diào)查顯示：部分患者的病毒載量在治療過程中增高但未檢測(cè)出耐藥基因突變位點(diǎn)，未發(fā)生臨床耐藥；發(fā)生臨床耐藥患者均使用的是一線抗病毒治療方案AZT＋3TC＋NVP／EFV，其中8例出現(xiàn)了耐藥位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的臨床耐藥。本次研究中，發(fā)生臨床耐藥患者均為男性，其中5例患者亞型為CRF01＿AE亞型，傳播途徑以同性性傳播為主（7例）。

2.5 HIV亞型與耐藥分布情況 9例發(fā)生臨床耐藥患者中，共發(fā)現(xiàn)4種不同基因型的HIV患者，分別為 CRF01＿AE、CRF68＿01B、CRF07＿BC 和 CRF02＿AG，CRF01＿AE亞型在臨床耐藥患者中占主要部分（表 3），各亞型耐藥率分別為 11.4% （5／44）、33.3%（2／6）、4.8%（1／21）、100%（1／1）。

表3 9例基因型耐藥患者2～4年臨床隨訪情況Tab.3 2-4 years follow up information of 9 patients with genotypic drug resistance

3 討論

我國(guó)自2003年陸續(xù)在全國(guó)各地開展HIV抗病毒治療，絕大多數(shù)患者得到了不同程度的癥狀改善，極大提高了生命質(zhì)量［4］，早期開展抗病毒治療已成共識(shí)［5］。近些年來我市不斷致力于拓寬社區(qū)美沙酮維持治療的覆蓋面，有針對(duì)性的對(duì)娛樂場(chǎng)所涉毒問題進(jìn)行專項(xiàng)整治，極大降低了靜脈注射毒品導(dǎo)致的艾滋病傳播，在本次研究中僅發(fā)現(xiàn)3例吸毒患者（2.7%）。我國(guó)主要的 HIV-1流行亞型包括B／B′、01＿AE、07＿BC 和 08＿BC 亞型［6］，本次研究結(jié)果顯示，江陰市主要流行的亞型有 CRF01＿AE（44／100）和 CRF07＿BC（21／100），與江蘇省艾滋病疫情主要發(fā)生地南京地區(qū)流行情況相似［7］。CRF07＿BC首次在中國(guó)的吸毒人群中發(fā)現(xiàn)，后迅速在全人群中迅速傳播［8］，本研究中發(fā)現(xiàn)3例經(jīng)靜脈吸毒感染患者，其中2例為CRF07＿BC亞型，需要對(duì)該亞型人群予以高度重視。

耐藥性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14例患者存在原發(fā)性耐藥突變位點(diǎn)，原發(fā)耐藥率 14.0%，對(duì) NRTIs、NNRTIs、PIs耐藥率分別為 3.0%、7.0%、6.0%，有9例患者在治療過程中出現(xiàn)耐藥位點(diǎn)相對(duì)的藥物耐藥，耐藥率為8.1%，絕大多數(shù)體內(nèi)含有針對(duì)NRTIs／NNRTIs耐藥位點(diǎn)的患者均發(fā)生了臨床耐藥，表明抗病毒治療失敗的HIV感染者發(fā)生NRTIs／NNRTIs耐藥的情況較普遍，需要引起重視。在NRTIs藥物中，1例患者體內(nèi)檢測(cè)出M184I位點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)3TC／FTC高度耐藥。對(duì)于NNRTIs藥物，突變位點(diǎn)比較多，除了對(duì)一代抗病毒藥物有不同程度耐藥外，也對(duì)二代抗病毒藥物產(chǎn)生耐藥性，其中Y181C為ETR高度耐藥突變提供了變異基礎(chǔ)，G190 A雖然不增加ETR的耐藥性，但對(duì)ETR的多重耐藥有協(xié)同作用，有研究發(fā)現(xiàn)，使用二線抗病毒方案的患者抗病毒效果較好，但是檢測(cè)出較多的PIs次要耐藥變異，建議在今后的治療中，對(duì)更換二線藥物治療患者進(jìn)行長(zhǎng)期耐藥監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)調(diào)制治療方案［9］。另有1例患者體內(nèi)僅存在針對(duì)PIs類藥物耐藥位點(diǎn)，治療藥物為非PIs類藥物，出現(xiàn)臨床耐藥，分析可能的原因是該患者治療期間存在不規(guī)則服藥情況，最終發(fā)生耐藥位點(diǎn)突變，這與隨訪結(jié)果相吻合。研究表明［10］，耐藥與服藥依從性差相關(guān)，在本次研究中也發(fā)現(xiàn)部分耐藥患者的服藥依從性差，因此加強(qiáng)患者服藥依從性，降低誘發(fā)HIV耐藥基因位點(diǎn)突變的可能，仍然是減少耐藥產(chǎn)生的重要手段。9例發(fā)生臨床耐藥的HIV-1感染者當(dāng)中，共發(fā)現(xiàn)4種不同亞型患者，以CRF01＿AE亞型耐藥患者為主，但由于樣本量較少，在本次研究中無法估計(jì)HIV-1基因型與耐藥發(fā)生之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的聯(lián)系，是本研究不足之處，希望以后在增加樣本量的同時(shí)盡可能的收集更多關(guān)于抗病毒治療患者的臨床信息，以便更加全面系統(tǒng)的分析耐藥與亞型之間的聯(lián)系。

綜上所述，結(jié)合本次原發(fā)性耐藥檢測(cè)結(jié)果以及臨床治療耐藥情況分析，新發(fā)HIV-1感染者在接受國(guó)家免費(fèi)抗病毒治療前，應(yīng)該進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，以便制定合理的抗病毒治療方案，促進(jìn)療效，減少耐藥株的產(chǎn)生與耐藥毒株間的傳播。

利益沖突：無