胡彥 劉潔 沈靜 朱大冕 馮鑫 陳林 詹建 歐喜超 周楊 趙雁林

耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是全球及我國嚴重的公共衛(wèi)生問題。我國是全球30個 MDR-TB高負擔國家之一，2016年估算我國新發(fā)結(jié)核病患者89.5萬例，耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者7.3萬例，新患者和復治患者中MDR/RR-TB的發(fā)生率分別為7.1%和24%[1]。重慶是中國西部唯一的直轄市，轄39個區(qū)(縣)，地區(qū)間發(fā)展不平衡，是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的高發(fā)區(qū)，MDR-TB發(fā)生率為23.0%[2-3]。重慶地區(qū)結(jié)核病耐藥疫情形勢嚴峻。

在MDR-TB的治療中，二線氟喹諾酮類(FQs)藥物尤為重要，是組成MDR-TB治療方案的核心藥物。但隨著FQs藥物在抗感染及結(jié)核病治療中的廣泛及不當應用，其耐藥率不斷增加。 筆者前期報道了重慶地區(qū)MDR-TB菌株氧氟沙星(Ofx)耐藥率為42.3%[3]，但對新一代的FQs耐藥性報告尚少見。北京基因型菌株是中國的主要流行株[4]，和其他基因型比較，由于北京基因型和耐藥性之間的高度關(guān)聯(lián)，其在耐藥結(jié)核病的傳播中起著重要作用[5]。Parwati 等[6]報告北京基因型菌株有更高的藥物耐藥相關(guān)基因的突變頻率，因此，本研究通過采用最低抑菌濃度(MIC)法對重慶地區(qū)新一代FQs藥物進行耐藥性檢測，并對不同基因型的耐藥突變位點進行分析，為重慶地區(qū)合理使用FQs藥物進行MDR-TB治療提供依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

收集2015年1月至2017年6月重慶市39個區(qū)(縣)結(jié)核病防治機構(gòu)報告的967例MDR-TB可疑患者，均痰涂片抗酸桿菌陽性。967例患者的臨床分離株經(jīng)菌種鑒定及比例法藥敏試驗，確定為MDR-TB菌株229株(23.7%)，分離自229例MDR-TB患者。其中，男173例，女56例；年齡17～79歲，平均(45.0士15.9)歲；初治患者84例，復治患者145例。

二、實驗方法

1. 主要儀器和試劑：PCR儀為美國Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀，Middle brook 7H9培養(yǎng)基購自美國BD公司(批號：5173939)，Alamar blue顯色液購自美國Bio-Rad公司(批號：160905)，氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)和加替沙星(Gfx)藥粉購自美國Sigma公司，批號分別為：SLBG3234V、BCBK5832V、SZBE216XV和SLBG5170V。

2. MIC檢測：使用7H9液體培養(yǎng)基(7H9∶OADC=9∶1)，通過微孔板Alamar blue顯色法測定FQs藥物的MIC值。本研究FQs藥物包括：Ofx、Lfx、Mfx、Gfx。MIC濃度梯度設(shè)置：0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml。刮取改良L-J(Lowenstein-Jenden)培養(yǎng)基上肉眼可見后1至2周的新鮮菌落，進行磨菌、比濁，制備1個麥氏(McFarland)單位濃度的菌懸液，50倍稀釋后取100 μl接種到不同濃度梯度的7H9液體培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)7 d后，加入70 μl顯色劑(Alamar blue∶5% Tween 80=2∶5)，24 h后觀察顏色變化判斷MIC讀數(shù)。MIC界定標準：藍色完全沒有發(fā)生改變的為最小藥物濃度。耐藥臨界濃度參照文獻[7-8]設(shè)置，Ofx、Mfx為2.0 μg/ml。Lfx、Gfx為0.5 μg/ml。

3. DNA提取：取適量經(jīng)改良L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長良好的菌落置于生理鹽水中，85 ℃孵育30 min滅活，離心收集菌體，用400 μl TE緩沖液懸菌，于95 ℃金屬浴60 min，16 200×g離心3 min，吸取上清液即作為DNA模板。

4. 耐藥基因PCR-測序：針對喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region，QRDR)設(shè)計PCR及測序引物，引物序列參照文獻[3]，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應體系為50 μl，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μl、引物各1 μl，模板3 μl，去離子水20 μl。PCR 擴增條件：94 ℃ 變性5 min；94 ℃，1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃，1 min，35個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科公司進行測序。測序結(jié)果通過在線比對軟件http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.與標準菌株H37Rv的耐藥相關(guān)基因序列進行比對分析。

5. 實時熒光PCR-熔解曲線基因分型：參照文獻[9-12]，Rv2952基因用于鑒定北京與非北京基因型，mutT2基因用于北京基因型古代與現(xiàn)代型的鑒定。 采用10 μl反應體系：10×反應緩沖液1 μl、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.4 μl、上游引物0.05 μl(0.02 μmol/L)、下游引物1 μl(0.4 μmol/L)、探針0.2 μl(0.2 μmol/L)、酶 0.2 μl、DNA 0.5 μl、雙蒸水6.65 μl。反應條件：預變性95 ℃ 2 min; 變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)，最終延伸72 ℃ 5 min。熔解曲線分析條件為：95 ℃變性5 min，40～80 ℃熔解曲線分析，每升高1 ℃采集1次熒光，檢測FAM和ROX 2個通道。引物和探針序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

二、 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件，兩個或多個獨立樣本率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率法(樣本量<40或理論頻數(shù)<1時)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、MDR-TB菌株FQs體外MIC結(jié)果

229株MDR菌株中，94株(41.0%，94/229)對任一FQs藥物耐藥，耐Lfx、Mfx、Gfx者均同時耐Ofx。Ofx耐藥率最高，為41.0%(94/229)，Lfx、Mfx耐藥率居中，分別為31.4%(72/229)、30.6%(70/229)，Gfx耐藥率最低，為20.1%(46/229)。復治患者的4種FQs藥物耐藥率均高于初治患者，但差異均無統(tǒng)計學意義。進一步分析發(fā)現(xiàn)，229株MDR菌株中Ofx耐藥率明顯高于Lfx(χ2=4.573，P=0.032)、Mfx(χ2=5.471，P=0.019)、Gfx(χ2=23.702，P=0.000)；Lfx、Mfx的耐藥率明顯高于Gfx(χ2=7.717，P=0.005；χ2=6.650，P=0.010)(表2)。

二、FQs耐藥相關(guān)基因分子特征與MIC分布

94株氟喹諾酮類耐藥表型菌株中，81株發(fā)生gyrA基因突變，突變率為86.2%(81/94)，涉及6個密碼子，共9種突變類型，分布在74、88、89、90、91和 94位點，94位突變頻率最高，為60.6%(57/94)。其中有7株為gyrA基因雙位點突變，顯示為高水平耐藥(Ofx、Lfx≥16 μg/ml，Mfx、Gfx≥4 μg/ml)，1株顯示為Gfx中等水平耐藥(Gfx: 2 μg/ml)。gyrA基因單位點突變主要類型為Asp94Gly(30株)、Ala90Val(16株)、Asp94Asn(7株)，其中，Ala90Val顯示為中低水平耐藥(Ofx、Lfx≤8 μg/ml，Mfx、Gfx≤2 μg/ml)。在135株氟喹諾酮敏感的MDR菌株中，有10株(7.4%，10/135)發(fā)生gyrA基因突變(表3)。

與gyrA基因相比，gyrB基因較少發(fā)生突變。94株氟喹諾酮耐藥株中，10株(10.6%)發(fā)生了gyrB基因突變。1株為單一突變，突變類型為Gly512Arg。9株發(fā)生了gyrA與gyrB基因的聯(lián)合突變，其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val顯示為高水平耐藥(表3)。

表1 基因分型 PCR引物及探針序列

表2 MDR-TB菌株對4種氟喹諾酮類藥物的藥物敏感性結(jié)果

注初治患者中，a：與Lfx比較，χ2=1.380，P=0.240；b：與Mfx比較，χ2=1.380，P=0.240；c:與Gfx比較，χ2=6.035，P=0.014；d：與Mfx比較，χ2=0.000，P=1.000；e:與Gfx比較，χ2=1.698，P=0.193；f:與Gfx比較，χ2=1.698，P=0.193。復治患者中，g:與Lfx比較，χ2=3.242，P=0.072；h:與Mfx比較，χ2=4.190，P=0.041；i：與Gfx比較，χ2=18.000，P=0.000；j：與Mfx比較，χ2=0.062，P=0.804；k：與Gfx比較，χ2=6.184，P=0.013；l：與Gfx比較，χ2=5.028，P=0.025

表3 MDR-TB 菌株gyrA、gyrB基因分子特征與最低抑菌濃度分布

注a：至少1種氟喹諾酮類藥物耐藥；b：4種氟喹諾酮類藥物均敏感

三、基因分型

229株MDR菌株中，非北京基因型菌株39株(17.0%，39/229)，北京基因型菌株190株(83.0%，190/229)。北京基因型中，古代型79株(41.6%，79/190)，現(xiàn)代型111株(58.4%，111/190)。在94株FQs耐藥株中，非北京基因型菌株14株(14.9%，14/94)，北京基因型菌株80株(85.1%，80/94)。北京基因型中，古代型32株(40.0%，32/80)，現(xiàn)代型48株(60.0%，48/80)。

四、耐藥基因在不同基因型間的突變情況

94株氟喹諾酮耐藥株中，gyrA、gyrB基因突變在北京與非北京基因型菌株間的分布見表4。進一步分析發(fā)現(xiàn)，gyrB基因突變率在非北京基因型、北京基因型古代型與現(xiàn)代型之間分別為2/14(14.3%)、8/32(25.0%)和0/48(0.0%)，現(xiàn)代北京型的gyrB基因突變率明顯低于古代北京型(χ2=10.700，P=0.001)和非北京型(Fisher確切檢驗，P=0.048)。

討 論

在MDR-TB的治療中，氟喹諾酮類藥物尤為重要，是組成MDR-TB治療方案的核心藥物之一。本研究發(fā)現(xiàn)，重慶地區(qū)MDR-TB 菌株任一FQs藥物的耐藥率為41.0%，接近巴基斯坦的47%[13]，但遠高于WHO報告的全球MDR-TB/RR-TB患者中對任一FQs的耐藥率20.0%[1]及我國臺灣地區(qū)的28.6%[14]，說明重慶地區(qū)對FQs的耐藥情況較為嚴重。初治患者4種FQs藥物的耐藥率雖均低于復治患者，但差異無統(tǒng)計學意義，說明重慶地區(qū)FQs藥物原始耐藥情況并不樂觀，可能是因為近年來FQs藥物在臨床上作為廣譜抗生素被廣泛應用于抗感染治療，不規(guī)范使用增加了其耐藥性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，初治患者的Ofx耐藥率與Lfx、Mfx差異無統(tǒng)計學意義，但顯著高于Gfx，可能與在一般抗感染治療中，重慶地區(qū)相對較少使用Gfx有關(guān)。在復治患者中，對Ofx的耐藥率與Lfx的差異無統(tǒng)計學意義，但明顯高于Mfx；對Gfx的耐藥率均明顯低于Ofx、Lfx、Mfx，可能與先前重慶地區(qū)較為普遍地使用Ofx、Lfx治療耐藥結(jié)核病有關(guān)。

表4 94株氟喹諾酮耐藥株gyrA和gyrB基因在北京與非北京基因型間的突變情況

注表中括號外數(shù)值為“菌株數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”；表中“-”表示不適用該統(tǒng)計方法

FQs藥物主要作用于細菌的 DNA 旋轉(zhuǎn)酶，使細菌 DNA 復制受阻，從而導致細菌死亡。DNA旋轉(zhuǎn)酶是由2個 A亞單位(GyrA)和2個 B 亞單位(GyrB)組成的四聚體，分別由gyrA和gyrB基因編碼[15-16]。由于不同地區(qū)結(jié)核病的流行病學、研究人群、二線抗結(jié)核藥物的使用情況等不同，各國家和地區(qū)所發(fā)現(xiàn)的gyrA、gyrB基因突變位點及頻率尚存在差異。本研究MDR結(jié)核分枝桿菌FQs耐藥株gyrA基因突變率為86.2%，高于我國臺灣地區(qū)的72.4%[17]、江西的82.1%[18]，低于華東地區(qū)的89.5%[19]。本研究中的突變位點包括74、88、89、90、91和94位密碼子，其中以94位密碼子突變最常見，占60.6%(57/94)，與華東地區(qū)、江西省報道的最常見突變位點一致，分別是56.8%和69.2%[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)了7株gyrA基因雙位點突變，與高水平耐藥相關(guān)(Ofx、Lfx≥16 μg/ml，Mfx、Gfx≥4 μg/ml)。gyrB基因發(fā)生突變的比例較小。94株FQs耐藥株中，10株(10.6%)發(fā)生了gyrB突變，高于江西的5.1%[18]，低于我國華東地區(qū)的11.6%和臺灣地區(qū)的31.0%[17,19]。9株為gyrA與gyrB基因聯(lián)合突變，其中Asp94Gly+Ala504Thr、Asp94Gly+Ala504Val顯示為高水平耐藥。

94株FQs耐藥株中有12株未發(fā)現(xiàn)gyrA或(和)gyrB基因突變，提示其他耐藥機制的存在，如gyrA/gyrB基因QRDR以外區(qū)域的突變、細胞壁滲透性降低和藥物外排泵等。關(guān)于10株gyrA基因突變及6株gyrB基因突變但對FQs不耐藥的菌株，其MIC水平多處于關(guān)鍵濃度值及其以下2個濃度，可能存在藥敏試驗結(jié)果判讀誤差或其他引起不準確的因素。

重慶地區(qū)MDR-TB菌株中，北京基因型菌株占83.0%，為本地區(qū)主要的流行菌株，且以現(xiàn)代型為主，與來自全國及部分省的數(shù)據(jù)一致[20-22]。在FQs耐藥株中，現(xiàn)代北京型的gyrB基因突變率明顯低于古代北京型和非北京型，提示現(xiàn)代北京基因型菌株可能相對不易發(fā)生gyrB基因突變，由于本地現(xiàn)代北京基因型菌株占多數(shù)，所以由gyrB基因突變可能導致的耐藥在本地FQs耐藥中并不起主要作用。

總之，本研究表明重慶地區(qū)MDR結(jié)核分枝桿菌對FQs藥物耐藥的情況不容樂觀，新一代FQs藥物的耐藥性相對較低，應盡快開展新一代FQs藥物的藥敏試驗。同時，應針對常見耐藥突變位點，建立適合本地區(qū)的對FQs耐藥的快速檢測方法，盡早為合理使用FQs藥物治療MDR-TB提供依據(jù)，以控制本地MDR-TB的傳播流行。