李翠 郝福順 王曉陽 孫立榮

摘 要：植物絲氨酸羧肽酶（SCP）以及絲氨酸羧肽酶類蛋白（SCPL），具有參與催化蛋白水解反應、傷應答反應，合成芥子酰基蘋果酸和油菜素內酯的作用。然而，這類蛋白是否調節(jié)植物應答其它逆境脅迫反應還不清楚。我們課題組以擬南芥T-DNA插入突變體庫篩選獲得一株對低鉀反應敏感的突變體，命名為kl58（K+ lower mutant 58）。KL58屬于SCP類蛋白家族，我們采用一些生物學基本技術，對該突變體進行了一些基本分析，以期為該方向的研究奠定基礎。

關鍵詞：絲氨酸羧肽酶；KL58；Tail-PCR

絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases， SCP）是一類主要大量而廣泛地存在于高等植物或真菌和動物組織中的真核生物細胞蛋白水解酶類。它參與多肽和蛋白質的加工、修飾與降解等多個關鍵環(huán)節(jié)，主要涉及如種子萌發(fā)過程中貯藏蛋白的水解、細胞程序性死亡中胞內組分自溶、創(chuàng)傷反應、抗逆等多個生理過程。目前，通過Northern雜交技術，RT-PCR技術分析和原位雜交技術等方法，從大麥、小麥、擬南芥等植物中分離到了SCP及SCP類蛋白（SCPL）的基因及它們編碼的蛋白質。研究人員發(fā)現水稻的SCPL家族中的OsBISCPL1基因，它主要在根部、葉片和葉鞘等部位中表達量比較高，在莖部表達量相對較低。另外還發(fā)現，OsBISCPL1過表達植株表現出對氧化脅迫的耐受性增加和相關的氧化脅迫基因表達上調。同時，還發(fā)現OsBISCPL1基因可能參與植物體對防御病原體感染的反應和抵抗氧化脅迫的調節(jié)。從煙草中分離得到的胞外型絲氨酸羧肽酶Ⅲ型基因NtSCP1和NtSCP2，在各個組織中都均有不同程度的表達，體外純化的His 標簽NtSCP1蛋白具有羧肽酶活性。

先前已經對SCP和SCPL編碼基因的部分進行了研究，但針對某一類基因或某些基因的功能還鮮有人報道。

一、主要實驗方法

1.β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色：將GUS染液加入離心管中，放入材料，避光，37℃染色2-4 h，依次用50%、75%、100%的乙醇脫色10 min。

2.擬南芥根細胞的質壁分離：將生長7 d的轉基因植株幼苗根浸泡在0.8 M甘露醇溶液中10-15 min，結束后用顯微鏡觀察。

3.DAPI染色：將生長7-8 d的轉基因幼苗浸泡到DAPI染液中，染色15-20 min后，用蒸餾水清洗3-4次，顯微鏡下觀察。

二、結果與分析

1.擬南芥KL58基因的獲得：在MS培養(yǎng)基上，該突變體與WT長勢和株型上沒有明顯差異，然而在含400M K+的培養(yǎng)基上，WT和kl58的生長都受到了不同程度的抑制，突變體植株矮小，側根減少，葉片萎蔫。與WT相比，kl58對低鉀脅迫更敏感（如圖2-1 A-2）。通過Tail-PCR技術確定導致kl58缺失的基因，如圖2-1 B 所示，從左向右的電泳泳道分別是第四輪、第三輪、第二輪、第一輪。把第四輪的目的條帶切膠回收，測序結果顯示，T-DNA反向插入在AT2G22920終止密碼子最后一個堿基前第四個堿基處，AT2G22920為絲氨酸羧肽酶基因SCP12。RT-PCR分析發(fā)現kl58中KL58沒有表達，而WT中能夠正常擴增出KL58的轉錄產物（圖2-1 C），說明kl58為基因完全缺失突變體。

2.KL58基因主要在幼苗根部表達：為了確定KL58的組織化學定位，構建了KL58pro：：GUS轉基因材料（圖2-2 A、B）。利用GUS染液染色，圖2-2 C顯示出了KL58在轉基因植株種子、幼苗、成苗、花、果莢中的組織表達情況，從圖中看出，KL58在種子中沒有表達；在3天幼苗的根部表達量最高，并且除去根尖外，其余根部都有大量表達，包括根的中柱和根毛；在3天的幼苗下胚軸和葉子中都沒有表達。在生長5天的KL58pr：：GUS植株中，同樣是根部表達量也非常高，幾乎整個根部都有表達，少量根尖除外；與生長3天不同的是5天幼苗下胚軸的基部有大量表達，在葉子中沒有表達。生長7天的幼苗根部表達量也非常高，下胚軸的基部有少量表達，葉子中沒有表達。而在第7天以后，根部的表達量較弱，11天個別葉子中有少量表達，下胚軸基部和根部銜接的部位表達量很高，在根部的其它部位，沒有觀察到有KL58的表達。在生長14天的幼苗中，植株的整個根部只能看到個別主根部位和側根部位有表達，下胚軸基部有少量表達，葉子中有少量表達。而在生長了21天的成苗中，只有個別根和葉子有少量表達。在花序結構中，花萼部分看到有少量表達，在花的其它結構如花藥、花絲、柱頭、花柱、子房等中都沒有觀察到表達，并且在花托部位也沒有觀察到表達。在果莢中也沒有觀察到KL58的表達。綜上所得，KL58在生長3-7天的幼苗根部表達量最高。

3.KL58亞細胞定位分析：為了觀察KL58基因亞細胞定位情況，構建了永久表達35S：：pEGAD：：KL58-GFP材料（圖2-3 A）。

將35S：：pEGAD：：KL58-GFP穩(wěn)定表達的轉基因擬南芥種子點在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將生長7 d左右的幼苗在激光共聚焦顯微鏡下進行GFP熒光掃描觀察。結果在幼苗根部檢測到了GFP綠色熒光（圖2-3 A）。從圖中我們可以看到，綠色熒光主要分布在細胞的周圍，也就是在細胞壁或者是細胞膜的部位，另外，還可以看到在個別細胞的內部也有顏色很亮的熒光，這個部位可能是細胞核。那么為了確定KL58是定位在細胞壁還是細胞膜，于是設計的質壁分離實驗，發(fā)現GFP熒光出現在根細胞質膜部位（圖2-3 B），而在細胞壁處沒有發(fā)現熒光。為了確定KL58是否在細胞核中存在，設計了DAPI染色實驗。細胞中的細胞核能夠被DAPI染成藍色。圖2-3 C所示，染DAPI的視野，顏色比較深的即為細胞核，綠色熒光視野中顏色深的部分與DAPI染色深的部分不重疊，說明KL58沒有定位在細胞核中。

4.KL58在細菌中誘導表達及Western-Blot檢測：為了測定KL58是否具有絲氨酸羧肽酶活性，我們構建原核表達載體，在體外表達出蛋白。圖2-4A是載體構建后的驗證電泳圖。

為了在體外誘導表達出KL58蛋白，將上述所得到的重組KL58-pET-28a質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，即將重組質粒轉入蛋白表達菌株。搖菌，用IPTG誘導融合蛋白表達，然后進行SDS-PAGE分析，結果顯示（圖2-4B 左），經0.3 mM IPTG誘導后，未誘導的菌液中沒有表達蛋白，誘導后全細菌裂解液含較多分子量大小與目的蛋白一致的條帶，即很可能為目的蛋白，而細菌裂解液經離心后的上清液中目的條帶的量較少，收集大量菌后才能為后續(xù)酶活性測定純化到到大量蛋白。為了驗證誘導出來的蛋白確實為帶His標簽的目的蛋白，于是做了Western-Blot檢測，結果顯示誘導大量表達出來的目的條帶確實為His標簽融合蛋白（圖2-4B）。

三、結語

RT-PCR分析證明，KL58在kl58中沒有表達。然而后期多次重復實驗發(fā)現，kl58在低鉀脅迫下的表型不穩(wěn)定。為揭示KL58的功能，研究了kl58在高鐵、高鋅、低鋅等脅迫下的表型，結果顯示，在這些脅迫下突變體與WT在生長和發(fā)育方面沒有顯著差別。構建了KL58pro：：GUS 載體，同時獲得了陽性GUS轉基因植株，對植株生長時期的各個部位進行組織化學染色，觀察到KL58在幼苗的根部表達較高，在幼苗期的葉子中表達較低，在種子、果莢及花序結構中沒有表達。構建了KL58基因融合綠色熒光蛋白（GFP）基因載體，研究KL58的亞細胞定位情況，證明KL58定位在細胞膜上。為確定 KL58是否具有絲氨酸羧肽酶活性，構建了KL58-pET-28a原核表達載體，并且成功在細菌中誘導表達出了該蛋白，為測定其絲氨酸羧肽酶活性奠定了基礎。

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作者簡介： 李翠（1987-），女，漢族，河南中牟人，現供職單位：鄭州電子信息職業(yè)技術學院 ，學位：理學碩士，研究方向：植物分子生物學。

通訊作者簡介：孫立榮（1968-），女，漢族，籍貫：山東省煙臺市萊山區(qū)高新區(qū)，供職單位：河南大學，職稱：副教授，學位：理學博士，研究方向：植物逆境生物學。

基金項目：河南省教育廳科學技術研究重點項目（15A210018）和國家自然科學基金項目（31070239）。