閘雯俊 楊芳 張艷茗

摘要：凝集素類受體蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶，但水稻（Oryza sativa L.）中OsLecRK家族的亞細(xì)胞定位及其生物學(xué)功能尚未清楚。依據(jù)NCBI公布的水稻OsLecRK的ORF序列設(shè)計(jì)引物，從水稻粳稻品種葉片cDNA中擴(kuò)增得到目的片段，構(gòu)建OsLecRK -GFP融合瞬時(shí)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位。激光共聚焦觀察結(jié)果表明，水稻OsLecRK蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsLecRK；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）17-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Lectin-like receptor kinase（LecRK） is a family of proteins which is unique and universal in plants. However， subcellular localization and biological function of OsLecRK family in rice（Oryza sativa L.） are largely unknown. OsLecRK gene was amplified from Nipponbare leaves cDNA based on the published ORF sequence on NCBI. Subcellular localization of OsLecRK protein was conducted by construction of transient expression vector OsLecRK-GFP and transformation of rice protoplasts. The confocal microscopy results showed that OsLecRK protein was located mainly in the cytoplasm， and built a good foundation for further research on the function of OsLecRK.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； OsLecRK； subcellular localization

水稻（Oryza sativa L.）是世界的主要糧食作物之一，全球超過一半人口以水稻作為主食[1]。水稻是中國最重要的口糧作物，常年種植面積約3 000萬hm2，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻的種植安全與中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和口糧安全密不可分。

凝集素類受體蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶。自1996年從擬南芥中第一次分離得到該家族成員Ath.lecRK后，人們已從多種植物中克隆到多個(gè)該類蛋白基因。研究表明，LecRK基因?qū)χ参锷L發(fā)育有一定的作用。擬南芥sgc是一種LecRK基因失活的突變體，由T-DNA插入At3g53810引起，突變體sgc由花粉時(shí)期開始，所有的花粉粒都開始變形和萎縮，從而引起雄性不育[2]。LecRK基因還廣泛參與植物與生物和非生物脅迫的互作。LecRK胞外的凝集素受體結(jié)構(gòu)域一直被認(rèn)為是與根瘤菌的共生和病原體的抵抗相關(guān)。最近的研究也證明了這個(gè)觀點(diǎn)，新發(fā)現(xiàn)的水稻抗稻瘟病Pi-d2就是一種包含甘露糖特異的凝集素受體蛋白激酶[3]。研究人員還利用T-DNA插入和RNAi方法將擬南芥中的LecRK4.1、LecRK4.2、LecRK4.3這3個(gè)基因分別敲除掉，結(jié)果顯示任一基因的失活可增強(qiáng)擬南芥對(duì)萌發(fā)時(shí)ABA的應(yīng)答[4]；與之相反，另一株突變體LecRK-b2在萌發(fā)時(shí)期對(duì)ABA的敏感度會(huì)降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)LecRK-b2基因也參與發(fā)育早期對(duì)鹽壓力和滲透壓的應(yīng)答[5]。

通過亞細(xì)胞定位可以了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的具體位置，而蛋白質(zhì)的功能與其在細(xì)胞中的定位緊密相關(guān)，從而可以對(duì)基因的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究蛋白亞細(xì)胞定位已有多種方法，常用的主要有融合報(bào)告基因定位法、免疫組織定位法、共分離標(biāo)記酶輔助定位法等[6]，其中以綠色熒光標(biāo)記GFP的應(yīng)用最為廣泛[7，8]。綠色熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，可以作為熒光標(biāo)記與目的蛋白質(zhì)融合表達(dá)并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞特定的組織來發(fā)揮功能，通過檢測(cè)綠色熒光在細(xì)胞中的位置來獲得目的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息。本研究通過LecRK基因的克隆和LecRK-GFP融合蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，為深入研究該基因在水稻中的功能奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌Top10，由糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 水稻材料 粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Zhonghua11）原種，由本實(shí)驗(yàn)室提供，用于提取水稻原生質(zhì)體。

1.1.3 植物表達(dá)載體 植物表達(dá)載體為pBWA（V）HS-gfp載體質(zhì)粒。

1.2 方法

1.2.1 中花 11 cDNA的制備 采用Trizol法提取中花11葉片組織的總RNA。采用TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM試劑盒將提取的中花11總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如表1所示，30 ℃，10 min；42 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。將制備好的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)水稻LecRK基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中序列設(shè)計(jì)引物，以中花11的cDNA為模板，擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的LecRK的ORF全長（去除終止子）。PCR引物為LecRK F（5′-ATGGCACCTCTCCTGTTCTTGC-3′）、LecRK R（5′-TCATGCGAGTGAACTGATATAG-3′）。

采用10 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)物濃度如表2所示。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.0 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的基因片段進(jìn)行切膠回收并純化。將純化的目的基因片段連接到pMD18-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果正確的菌種進(jìn)行保存并命名為pBWA（V）HS-OsLecRK-GFP。

1.2.3 水稻中花11原生質(zhì)體的提取 將水稻去殼后，以70%乙醇清洗2 min，再以0.5%氯化汞清洗15 min，然后種植于1/2 MS培養(yǎng)基，28 ℃暗培養(yǎng)8～14 d。取幼苗，把根切下后浸在0.6 mol/L甘露醇中，用無菌刀片切成0.5 mm的小塊，放入10 mL酶解液[2.5% cellulase R-10（Yakult）、0.75% macerozyme R-10（Yakult）、0.6 mol/L D-甘露醇、10 mmol/L MES（pH 5.7）]，55 ℃加熱10 min，此時(shí)顏色變?yōu)樯钭厣?，自然冷卻之后再加入0.1% BSA、10 mmol/L CaCl2，加 ddH2O至10 mL，于150 mL三角瓶中28 ℃、50 r/min避光孵育4～5 h。孵育結(jié)束后加入等體積的W5 solution[154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES（pH 5.7）]，輕輕搖勻使原生質(zhì)體充分釋放。用150目不銹鋼細(xì)胞篩將液體過濾到干凈的培養(yǎng)皿中，再用電動(dòng)移液器小心轉(zhuǎn)移至50 mL圓底離心管中，4 ℃、100 g吊籃離心8 min收集原生質(zhì)體。余少量上清液將沉淀輕輕搖散，小心以4 mL W5 solution將原生質(zhì)體重新沖洗懸浮，4 ℃、100 g吊籃離心4 min。去上清液，小心地以4 mL Mmg solution[0.4 mol/L D-甘露醇、20 mmol/L MgCl2、5 mmol/L MES（pH 5.7）]將原生質(zhì)體重新沖洗懸浮，4 ℃、100 g吊籃離心4 min。去上清液，以 2 mL Mmg solution重新懸?。ù藭r(shí)取20 μL懸浮液進(jìn)行鏡檢）。

1.2.4 水稻中花11原生質(zhì)體的PEG轉(zhuǎn)化 提取的水稻原生質(zhì)體冰浴30 min，23 ℃、100 g吊籃離心2 min，去上清液。用轉(zhuǎn)化數(shù)N×100 μL Mmg solution重新懸浮原生質(zhì)體，以備轉(zhuǎn)化。2 mL離心管中先加入10 μL亞細(xì)胞定位載體，以及10 μL細(xì)胞核指示載體Ghd7-CFP或PXDR-OsH2A混勻，再用剪口槍頭吸取100 μL懸浮原生質(zhì)體輕彈混勻，最后加入120 μL 40% PEG3350[0.4 mol/L D-甘露醇、100 mmol/L CaCl2、40%（V/V）PEG3350]輕彈混勻，室溫孵育20 min。加入500 μL W5 solution混勻終止反應(yīng)，23 ℃、100 g吊籃離心2 min。去掉大部分上清液，將沉淀轉(zhuǎn)移至有1.5 mL W5 solution的12孔板中，28 ℃暗培養(yǎng)過夜（16 h以上）。次日將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中23 ℃、100 g吊籃離心2 min，去掉大部分上清液，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsLecRK基因的克隆與亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

以中花11 cDNA為模板，擴(kuò)增OsLecRK基因到終止密碼子前的全長ORF序列，長2 426 bp。將目的片段連接到pBWA（V）HS-GFP載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，取PCR鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，克隆序列正確，載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 OsLecRK蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位

提取轉(zhuǎn)染級(jí)別的質(zhì)粒，在40% PEG3350的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體，28 ℃暗培養(yǎng)16 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號(hào)。結(jié)果表明，OsLecRK蛋白質(zhì)分主要布于細(xì)胞質(zhì)中（圖3）。

3 小結(jié)與討論

對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位是一種較為直觀的研究方法，可以通過目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位情況來預(yù)測(cè)其功能。目前，被廣泛應(yīng)用的能進(jìn)行亞細(xì)胞定位的報(bào)告基因主要是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。綠色熒光蛋白是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的一個(gè)重要工具，綠色熒光蛋白相對(duì)分子質(zhì)量很小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白質(zhì)的特性，因此是一種直觀性很強(qiáng)的遺傳標(biāo)記物[9]。本研究利用融合綠色熒光蛋白及水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)水稻OsLecRK蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。與空載相比，OsLecRK蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布存在差異。OsLecRK蛋白亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果為進(jìn)一步篩選其互作蛋白，研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] KHUSH G S.Origin，dispersal，cultivation and variation of rice[J].Plant Mol Biol，1997，35（1-2）：25-34.

[2] WAN J，PATEL A，MATHIEU M，et al. A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology，2008，67（5）：469-482.

[3] CHEN X，SHANG J，CHEN D，et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance[J].The Plant Journal，2006， 46（5）：794-804.

[4] XIN Z，WANG A，YANG G，et al. The Arabidopsis A4 subfamily of lectin receptor kinases negatively regulates abscisic acid response in seed germination[J].Plant Physiology，2009，149（1）：434-444.

[5] DENG K，WANG Q，ZENG J，et al. A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response[J].Journal of Plant Biology，2009，52（6）：493-500.

[6] 邢浩然，劉麗娟，劉國振.植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究進(jìn)展[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（S2）：1-6.

[7] NIEDENTHAL R，RILES L，JOHNSTON M，et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression and subcellular localization in budding yeast[J].Yeast，1996，12（8）：773-786.

[8] CHALFIE M，TU Y，EUSKIRCHEN G，et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science，1994，263（5148）：802-805.

[9] 李 歡，楊皓宇，燕景洲，等.GFP在植物分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志，2008，25（5）：55-57.