吳兆圓 張亞妮 王燕

摘要：真菌次生代謝產(chǎn)物一直以來都是藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來源。在真菌源農(nóng)藥活性天然產(chǎn)物的篩選過程中，得到1株具有殺菌和殺蟲活性的真菌NBERC_170302，通過活性跟蹤以及菌株大量發(fā)酵，經(jīng)提取和制備高效液相色譜分離純化得到其中的活性化合物，并通過X-射線單晶衍射鑒定為Viridicatumtoxin A，進(jìn)一步農(nóng)藥活性測試表明，對多種農(nóng)業(yè)致病真菌具有抑制作用，其中對于小麥赤霉菌、灰霉菌和小麥穎枯病菌具有明顯活性，并具有中等殺小菜蛾的活性。

關(guān)鍵詞：真菌；Viridicatumtoxin A；抗菌活性；殺蟲活性

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0056-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.014 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Secondary metabolites from fungal have always been an important source of drugs and leading compounds. In the search for pesticides of natural products from fungus， fungus NBERC_170302 with fungicidal and insecticidal activity was obtained. By active tracking and large-scale fermentation， the active compound was obtained and identified as Viridicatumtoxin A by LC-MS and X-Ray diffraction. Viridicatumtoxin A was found to show fungicidal activities to several agricultural pathogenic bacteria， and insecticidal activity to Plutella xylostella by further bioassay.

Key words： fungi； Viridicatumtoxin A； fungicidal activity； insecticidal activity

從天然產(chǎn)物中獲得潛在先導(dǎo)化合物仍然是當(dāng)今藥物開發(fā)最有效的策略之一，真菌恰恰是探索發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物的重要資源之一。自1928年Fleming從點青霉（Penicillium notatum）中首次發(fā)現(xiàn)抗生素青霉素以來，在不到100年的時間里，有多種真菌來源的化合物被開發(fā)成新型藥物[1]。真菌代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新異，作用靶點獨特，具有廣譜、低毒、低殘留且受環(huán)境影響較小等特點，因此真菌代謝產(chǎn)物農(nóng)藥的開發(fā)不僅對生態(tài)環(huán)境，而且對社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重要意義。20 世紀(jì)90年代，英國捷利康公司和德國巴斯夫公司以擔(dān)子菌Strobilurus tenacellus的代謝產(chǎn)物Strobilurins為模型，創(chuàng)制了甲氧丙烯酸酯類殺菌劑[2]，它們不僅殺菌譜廣，除了對三唑類殺菌劑能防治的擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌有明顯效果外，對卵菌引起的病害也十分有效，而且還有促進(jìn)小麥增產(chǎn)作用[3]。另外，已有近百年歷史的植物生長調(diào)節(jié)劑赤霉素A是E. Kuiosawa 1926年從感染串珠鐮孢（Fusarium moniliform Sheldon）的水稻中分離出來的，隨后英國捷利康公司分離到赤霉酸，開發(fā)成產(chǎn)品。近年來，從真菌代謝產(chǎn)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多具有開發(fā)前景的活性組分，如交鏈孢酸（Alternaric acid）在50 μg/mL濃度下對黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）抑制作用明顯，100 μg/mL濃度下抑制率可達(dá)100%，與速克靈有相似的抗菌譜[4]；日本曲霉的代謝產(chǎn)物黑麥酮酸F（SAF）在0.038 μg/mL濃度下就能明顯抑制雙子葉植物（洋油菜、蘿卜等）的萌發(fā)和種苗生長[5]。從盤多毛屬（Pestalotiopsis spp.）真菌中分離的一系列具有環(huán)己酮分子骨架的化合物，抑制病菌生長的最低濃度僅為6.5 μg/mL，不僅對擔(dān)子菌和子囊菌有活性，而且對卵菌有殺傷活性，殺菌譜近似于Strobilurins，具有明顯的商業(yè)開發(fā)價值[6，7]。

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物農(nóng)藥資源研究室在農(nóng)藥活性真菌代謝產(chǎn)物的篩選過程中，得到1株具有抗菌和殺蟲活性的真菌NBERC_170302，通過活性追蹤，確定了其中的目標(biāo)活性化合物，通過大量發(fā)酵、提取、分離純化得到了活性化合物1（圖1），經(jīng)LC-MS和X-Ray衍射鑒定為Viridicatumtoxin A，并對其農(nóng)藥活性進(jìn)行測試，以期為這方面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）、Bruker APEX DUO單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國Bruker BioSpin公司）；Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀、Waters 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統(tǒng)，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0）（美國Waters公司）；美國Sunfire C18 OBD制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.2 微生物

菌株分離于長江灘涂土壤（2017年3月采樣），現(xiàn)菌種保存在湖北生物農(nóng)藥工程研究中心，編號NBERC_170302。

1.3 菌株的培養(yǎng)和提取

菌株NBERC_170302的種子發(fā)酵在ISP-2培養(yǎng)基（麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調(diào)至7.0）中，于28 ℃，以轉(zhuǎn)速120 r/min進(jìn)行振搖培養(yǎng)。發(fā)酵96 h后，在無菌條件下將種子發(fā)酵液（10%）錐形瓶中，含大米培養(yǎng)基（100 g大米，加入150 mL水，高溫滅菌），在28 ℃下，靜置培養(yǎng)120 h。

初篩時發(fā)酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機(jī)相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。大量發(fā)酵10 L的發(fā)酵液中加入10 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物0.9 g。

1.4 活性跟蹤和分離純化

活性跟蹤取800 μL初篩樣品進(jìn)行半制備（Sunfire C18 OBD半制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL/min），洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，得到36個組分，溶劑蒸發(fā)后作為活性測試樣品。

大量發(fā)酵的乙酸乙酯提取物溶解于甲醇中，用制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，24 mL/min）進(jìn)行粗分，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，然后用半制備柱對化合物進(jìn)行細(xì)分，采洗脫梯度5%～100%，得到化合物1（7.90 mg）。取1 mg樣品用甲醇溶解，使其結(jié)晶，作為X-Ray衍射用；另取1 mg樣品作為活性測試用。

1.5 抗菌活性測試

選取小麥赤霉菌（Fusaium graminearum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、灰霉菌（Botrytis cinema）、小麥穎枯病菌（Swptoria nodorum）、番茄早疫菌（Alternaria solani）作為試驗用病菌，菌株由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物資源研究室提供，菌種保存溫度為-70 ℃。采用半固體培養(yǎng)法，以標(biāo)準(zhǔn)PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.7%瓊脂配制成感染培養(yǎng)基，樣品以含0.05%TW-80的無菌水溶解，活性跟蹤組分樣品加5 mL去離子水后取20 μL作為生測樣品，純品初始濃度為20 mg/mL，均采用3個濃度梯度，依次對半稀釋。培養(yǎng)條件：溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照度3 000 lx。從第二天開始檢查并記錄活性，根據(jù)殺菌活性反應(yīng)的不同，使用分級指標(biāo)數(shù)（0、3、5、7、9）標(biāo)記殺菌活性[8]。

1.6 殺蟲活性測試

選取豆蚜（Aphis craccivora）、小菜蛾（Plutella xylostella）及棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）作為測試對象，初孵幼蟲由本中心微生物資源研究室提供。蚜蟲活性測試采用浸液法，小菜蛾和棉鈴蟲采用人工飼料表面涂布法。活性跟蹤組分樣品中加入90 μL DMSO和4.41 mL水，混勻，取100 μL作為生測樣品，純品初始濃度為100 μg/mL，均采用3個濃度梯度，依次稀釋1倍。在樣品中接入供試幼蟲，在人工氣候室中培養(yǎng)，于96 h后檢查結(jié)果?；钚越Y(jié)果采用目測分級法進(jìn)行，按0、3、5、7、9分級，0表示無活性，指標(biāo)為幼蟲與加入溶劑的對照組幼蟲生長狀況一致，9表示活性為100%，指標(biāo)為幼蟲全部死亡，在0和9之間設(shè)置3個級別。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1（圖1）：黃色針晶；UV（MeOH）λmax為238、285、434 nm；ESI-MS（陽離子），548.5、566.4[M+1]+；ESI-MS （陰離子），564.4[M-1]-。根據(jù)X-Ray單晶衍射結(jié)果分析，并結(jié)合文獻(xiàn)[9]報道，化合物1鑒定為Viridicatumtoxin A。

2.2 活性測試結(jié)果

殺菌活性和殺蟲活性評分結(jié)果見表1和表2。殺菌活性測試結(jié)果表明，化合物1對所有測試的致病菌種菌顯示有活性，其中對小麥赤霉、灰霉菌、小麥穎枯菌有明顯的抗菌活性，在5 μg/mL濃度下，活性評分大于5，尤其對于小麥赤霉菌、灰霉菌這2種致病菌，活性評分大于9（菌種未生長），分別與陽性對照嘧菌酯和咪鮮胺相當(dāng)。另外，殺蟲活性測試表明，化合物1對小菜蛾具有一定的殺滅作用，其有效濃度為50 μg/mL，具有中等殺蟲活性。

3 討論

Viridicatumtoxin A是由真菌產(chǎn)生的一種罕見的四環(huán)素類的天然產(chǎn)物，其最早于1973年被當(dāng)作真菌毒素從Penicillium viridicatum分離得到[10]。該化合物的絕對構(gòu)型通過單晶衍射被Silverton等[11]確認(rèn)。毒理試驗表明，其對小鼠（口服劑量為350 mg/kg）和大鼠（口服劑量為350 mg/kg）基本無毒[12]?；钚匝芯勘砻鳎琕iridicatumtoxin A具有良好的抗菌活性，尤其是針對臨床上的耐藥菌，如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA），其對MRSA的抑制率比四環(huán)素高8～64倍[13]，另外，其對甲氧西林完全耐藥的超級耐藥菌也顯示具有顯著的抗菌活性[9]，表明這一化合物具有極大的研究開發(fā)價值。

本試驗通過活性跟蹤、大量發(fā)酵及分離純化，從活性菌株NBERC_170302中得到了化合物Viridicatumtoxin A，通過單晶衍射確定其結(jié)構(gòu)。首次測試化合物對農(nóng)業(yè)致病真菌和害蟲的活性，活性測試結(jié)果表明其對小麥赤霉菌、灰霉菌及小麥穎枯病菌均具有明顯殺菌活性，對小菜蛾具有中等的殺蟲活性。因此，可對其進(jìn)行抗真菌方面的研究，為真菌源殺菌劑的開發(fā)提供良好的研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 季 波，肖依文，朱 篤.正青霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（4）：686-694.

[2] 張一賓.由甲氧丙烯酸酯類抗生素開發(fā)農(nóng)用殺菌劑[J].農(nóng)藥譯叢，1995，17（3）：25-29.

[3] BARTETT D W，CLOUGH J M，GODFREY C R A，et al. Understanding the strobilurin fungicides[J].Pesticide Outlook，2001， 4（12）：143-148.

[4] LIEBERMANN B，NUSSBAUM R P，GUNTHER W. Bicycloalternarenes produced by the phytopathogenic fungus Alternaria alternata[J].Phytochemistry，2000，32（10）：987-992.

[5] ZENG R S，LUO S M，SHI Y H，et al. Physiological and biochemical mechanism of allelopathy of secalonic acid F on higher plants[J].Agronomy Journal， 2001，93（1）：72-79.

[6] LI J Y，HARPER J K，GRANT D M，et al. Ambuic acid， a highly functionalized cyclohexenone with antifungal activity from Pestalotiopsis sp. and Monochaetia sp.[J].Phytochemistry，2001， 56（5）：463-468.

[7] STROBEL G，YANG X，SEARS J，et al. Toxol from Pestalotiopsis microspora，an endophytic fungus of Taxus wallachiana[J].Microbiology，1996，142（2）：435-440.

[8] 張志剛，楊自文，王開梅，等.微生物源殺菌劑先導(dǎo)化合物篩選研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（23）：5896-5899.

[9] SHANG Z，SALIM A，KHALIL Z，et al. Viridicatumtoxins：Expanding on a rare tetracycline antibiotic scaffold[J].Journal of Organic Chemistry，2015，80（24）：12501-12508.

[10] HUTCHISON R D，STEYN P S，VAN RENSBURG S. Viridicatumtoxin，a new mycotoxin from Penicillium viridicatum westling[J].Toxicology and Applied Pharmacology，1973，24（3）：507-509.

[11] SILVERTON J V，KABUTO C，AKIYAMA T. The structure and absolute configuration of viridicatumtoxin：2′S-（2′，7′a，11′a，12′）-7′，7′a，8′，11′，11′a，12′-hexahydro-5′，6′，7′a，10′，11′a，12′-hexahydroxy-3′-methoxy-2，6，6-trimethyl-7′，8′-dioxospiro[2-cyclohexene-1，2′（1′H）-cyclopenta[de]naphthacene]-9′-carboxamide methanolate[J].Acta Crystallographica Section B，1982，38：3032-3037.

[12] BENDELE A M，CARLTON W W，NELSON G E，et al. Viridicatumtoxin mycotoxicosis in mice and rats[J].Toxicology Letters，1984，22（3）：287-291.

[13] CHOOI Y H，CACHO R，TANG Y. Identification of the Viridicatumtoxin and griseofulvin gene clusters from Penicillium aethiopicum[J].Chemistry & Biology 2010，17（5）：483-494.