張 偉，張 沛，孫 忻，李 莉*

(1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 吉林長春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的革蘭性陽性機(jī)會致病菌，也是一種重要的人獸共患致病菌，其感染可以引起人和動(dòng)物的細(xì)菌性腦炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥等多種疾病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和人類健康。根據(jù)莢膜抗原的不同，通常將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型(1～34,1/2)[1-2]，其中豬鏈球菌2型是毒力最強(qiáng)、臨床分離率最高的血清型，感染后表現(xiàn)高致病性和高致死率的臨床特征[3-5]。目前，臨床實(shí)踐上主要采用抗生素來應(yīng)對豬鏈球菌的感染，而傳統(tǒng)抗生素主要是通過抑菌或殺菌的方式發(fā)揮治療作用，容易給病原菌造成較大的生存選擇壓力，進(jìn)而易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，影響治療效果。因此，面對著日益嚴(yán)重的豬鏈球菌耐藥性問題，臨床上急需新的抗感染思路和策略。

隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等前沿學(xué)科的發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)病原菌致病作用及毒力的發(fā)揮與其攜帶或分泌的毒力因子有著密切聯(lián)系，毒力因子在整個(gè)致病過程中起著重要的作用[6]。豬鏈球菌所攜帶或分泌的溶血素、分選酶及溶菌酶釋放蛋白等毒力因子在其致病過程中起著重要作用[7]。豬鏈球菌溶血素(suilyin，SLY)是一種屬于膽固醇依賴性家族的成孔毒素，被認(rèn)為是一種重要的毒力因子。Staats J J等[8]從死亡率、發(fā)病率和病理學(xué)角度對豬鏈球菌進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)SLY陽性豬鏈球菌2型是高毒力豬鏈球菌菌株。也有研究表明，相較于野生株，SLY缺失型菌株毒力顯著下降，在豬鏈球菌感染小鼠模型中幾乎不引起小鼠死亡[9]。Takeuchi D等[10]通過對小鼠感染豬鏈球菌模型分析，發(fā)現(xiàn)SLY是豬鏈球菌的一種重要毒力因子。接種溶血素敲除株和溶血素低分泌株的小鼠死亡率顯著低于接種野生株小鼠。其研究還發(fā)現(xiàn)SLY在豬鏈球菌腦炎中發(fā)揮著作用，SLY高分泌菌株更容易誘發(fā)細(xì)菌性腦炎，進(jìn)而提示SLY在豬鏈球菌透過血腦屏障的過程中發(fā)揮一定作用。此外，SLY可以損傷宿主內(nèi)皮等細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性，有助于細(xì)菌躲避宿主免疫系統(tǒng)的清除[9]。因此，SLY是治療和控制豬鏈球菌感染新型藥物開發(fā)的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。

姜黃很早便有入藥記載，是一味傳統(tǒng)的中藥，主要來源于姜科植物根系，具有活血、行氣等多種功效，現(xiàn)代中藥學(xué)研究表明，姜黃還具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[11]。本研究選擇SLY為作用靶標(biāo)，通過溶血活性抑制試驗(yàn)和生長曲線的測定試驗(yàn)等驗(yàn)證分析姜黃提取物對SLY生物活性和豬鏈球菌生長的影響，并通過體外細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃提取物對豬鏈球菌毒力發(fā)揮的影響，為臨床治療豬鏈球菌感染藥物開發(fā)提供新的思路和一種潛在的先導(dǎo)天然復(fù)合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 豬鏈球菌2型菌株ZY05719由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)范紅結(jié)教授惠贈；腺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞A549和小鼠巨噬細(xì)胞J774為吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀，美國伯騰，Synergy HT公司產(chǎn)品；姜黃，安徽匯中州中藥飲片有限公司產(chǎn)品；二甲基亞砜，Sigma公司產(chǎn)品；THB(todd-hewitt broth)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Trans well小室，美國Corning 公司產(chǎn)品；DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒，Roche試劑公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 姜黃提取物的制備 精確稱取2 kg姜黃粗粉，溶解于3 L含量700 mL/L乙醇中進(jìn)行回流提取，反復(fù)在60 ℃條件下進(jìn)行3次回流提取，每次進(jìn)行6 h，合并上述提取到的回流液，用脫脂棉進(jìn)行過濾并收集濾液，在45℃下進(jìn)行減壓濃縮至浸膏后，經(jīng)過真空干燥至恒重，得到姜黃提取物。用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)制備終濃度為10 240 μg/mL工作液備用。

1.2.2 最小抑菌濃度的測定 采用肉湯微量稀釋法測定姜黃提取物對豬鏈球菌ZY05719的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)[9]。

1.2.3 生長曲線的測定 挑取豬鏈球菌ZY05719單菌落于2 mL THB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取200 μL上述菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL THB培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期即OD 600 nm=0.3，等量分裝至50 mL三角錐形瓶，并且分別加入提取的上述姜黃提取物工作液，使共培養(yǎng)體系中姜黃素提取物的終濃度分別達(dá)到0、8、16、32、64 μg/mL，其中未加入姜黃提取物組加入等體積的DMSO，每隔60 min分別測定每個(gè)樣品光密度值并繪制出其生長曲線。

1.2.4 溶血素活性抑制試驗(yàn) 同“1.2.3”中細(xì)菌培養(yǎng)操作，培養(yǎng)至數(shù)生長期后，等量分裝至50 mL錐形瓶，并且分別加入上述姜黃提取物工作液，使共培養(yǎng)體系中姜黃素提取物的終濃度分別達(dá)到0、8、16、32、64 μg/mL，其中未加入姜黃提取物組加入等體積的DMSO繼續(xù)培養(yǎng)對數(shù)生長后期，將細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心(10 000 r/min、1 min)獲得上清液。取875 μL PBS (phosphate buffer saline)、100 μL上述培養(yǎng)物上清以及入25 μL脫纖維兔紅細(xì)胞于1.5 mL離心管中，混合均勻，靜置于37℃ 30 min，10 000 r/min離心1 min，取上清液測定543 nm光密度值(OD)。

1.2.5 Trans well小室穿膜試驗(yàn) 選用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞(37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2，濕度95%)，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，并鋪板加入于Trans well小室(6×104個(gè)細(xì)胞/小室)中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞在小室長滿。同1.2.3中細(xì)菌培養(yǎng)操作，豬鏈球菌2型ZY05719培養(yǎng)至OD 600 nm=0.3后，用含有2.5 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將上述菌液稀釋至濃度為1×108CFU/mL，同時(shí)加入姜黃提取物工作液，使終濃度分別達(dá)到0、8、16、32、64 μg/mL。取含不同濃度姜黃提取物的上述稀釋好的菌液加入小室，每室200 μL，37℃靜置孵育30 min，收集下室培養(yǎng)物，依次進(jìn)行倍比稀釋，均勻涂布于固體THB培養(yǎng)基上計(jì)算細(xì)菌穿透膜的成功率，穿透率=穿入下室的菌體量/加到小室的菌體量×100%。

1.2.6 LDH釋放檢測試驗(yàn) 選用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞J774，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，加入96孔板中，每孔5×104CFU，同1.2.3中細(xì)菌培養(yǎng)操作，豬鏈球菌2型ZY05719培養(yǎng)至OD 600 nm=0.3后，用DMEM培養(yǎng)基將上述菌液稀釋至濃度為1×108CFU/mL，同時(shí)加入姜黃提取物工作液，使終濃度分別達(dá)到0、8、16、32、64 μg/mL。取含不同濃度姜黃提取物的上述稀釋好的菌液10 μL加入每孔，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下靜置培養(yǎng)5 h，離心(1 000 r/min 10 min)，取上清液，按照LDH檢測試劑盒操作說明，用酶標(biāo)儀在490 nm下測定上清液的光密度值，并計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞LDH的釋放量。

2 結(jié)果

2.1 姜黃提取物的體外抑制結(jié)果

MIC測定試驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃提取物對豬鏈球菌的MIC濃度高于1 024 μg/mL，提示姜黃提取物幾乎無抑菌活性，并且姜黃提取物在作用濃度8 μg/mL～64 μg/mL條件下對豬鏈球菌的生長幾乎無影響，結(jié)果見圖1。說明姜黃提取物對豬鏈球菌幾乎無生存選擇壓力。

圖1 豬鏈球菌在不同姜黃提取物濃度作用下的的生長曲線

2.2 姜黃提取物抑制SLY溶血活性結(jié)果

SLY具有細(xì)胞毒性，可以直接裂解紅細(xì)胞。溶血素活性抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過不同濃度姜黃提取物與豬鏈球菌共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)物上清的溶血活性被明顯抑制，結(jié)果見圖2。當(dāng)姜黃提取物濃度為64 μg/mL時(shí)，共培養(yǎng)物上清的溶血活性僅為對照組的22.36%，并且該抑制作用呈顯著的劑量依賴性。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)

“*” means significant difference(P<0.05).“**” means extremely significant difference(P<0.01)

圖2姜黃提取物對豬鏈球菌培養(yǎng)物上清溶血活性的抑制作用

Fig.2 Inhibitory effect of curcuma extract on hemolytic activity ofS.suisculture supernatant

2.3 姜黃提取物降低豬鏈球菌穿透上皮細(xì)胞屏障能力結(jié)果

通過體外細(xì)胞試驗(yàn)分析了姜黃提取物對豬鏈球菌穿過上皮細(xì)胞屏障的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，姜黃提取物可以顯著抑制豬鏈球菌穿透上皮細(xì)胞屏障的能力，并且這一抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)姜黃提取物濃度分別達(dá)到32 μg/mL和64 μg/mL時(shí)，豬鏈球菌穿透上皮細(xì)胞的通透率明顯下降，此結(jié)果與姜黃提取物抑制豬鏈球菌培養(yǎng)物上清溶血活性一致。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)

“*” means significant difference(P<0.05).“**” means extremely significant difference(P<0.01)

圖3姜黃提取物對豬鏈球菌模擬穿透上皮細(xì)胞屏障的作用

Fig.3 The effect of curcuma extract onS.suistraversal across epithelial barrier

2.4 姜黃提取物對豬鏈球菌介導(dǎo)細(xì)胞毒性LDH的作用結(jié)果

采用LDH試劑盒檢測了細(xì)菌和姜黃提取物共感染體系中LDH釋放量，結(jié)果見圖4。圖4的定量結(jié)果表明，姜黃提取物可以顯著保護(hù)豬鏈球菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。豬鏈球菌和J774細(xì)胞共培養(yǎng)后表現(xiàn)了明顯的毒性作用，造成細(xì)胞大量死亡。但加入不同濃度的姜黃提取物后，LDH釋放量顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性，說明死亡細(xì)胞顯著降低。當(dāng)姜黃提取物濃度分別達(dá)到32 μg/mL和64 μg/mL時(shí)，相較于未加入姜黃提取物組，加入姜黃提取物組LDH釋放量極顯著降低(P<0.01)。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)

“*” means significant difference(P<0.05).“**” means extremely significant difference(P<0.01)

圖4姜黃提取物緩解豬鏈球菌所誘導(dǎo)的對宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

Fig.4 Effect of curcuma extract on relief ofS.suis-induced cytotoxicity

3 討論

抗生素的發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用對人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出不可磨滅的貢獻(xiàn)。但自從青霉素應(yīng)用以來，任何新型抗生素的使用都會在短短幾年內(nèi)出現(xiàn)對該抗生素產(chǎn)生顯著抵抗性的現(xiàn)象。而目前為止，新抗生素研發(fā)的速度遠(yuǎn)不及細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的速度。美國傳染病學(xué)會估計(jì)，70%的美國醫(yī)院獲得性感染對1種或多種抗生素具有抗性。然而，除了最近開發(fā)的窄譜藥物達(dá)托霉素和利奈唑胺以外，在40多年中沒有發(fā)現(xiàn)新類別的臨床相關(guān)抗生素[12]。傳統(tǒng)抗生素的主要作用機(jī)制多為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核苷酸及蛋白質(zhì)等細(xì)菌生存所必須成分，因而給予了細(xì)菌較大的生存選擇壓力，極易誘導(dǎo)抗藥性的產(chǎn)生[6,13]。因而，新的抗感染策略和機(jī)制迫切需要被提出，與傳統(tǒng)抗生素作用不同，抗毒力策略選擇細(xì)菌攜帶分泌的毒力因子作為靶點(diǎn)，而不是作用于細(xì)菌本身，因而給細(xì)菌較強(qiáng)的生存選擇壓力，從而可以減緩細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生，還可以顯著降低細(xì)菌毒力，越來越多的受到人們關(guān)注[14]。

豬鏈球菌攜帶分泌多種毒力因子，其中SLY是豬鏈球菌的一種重要的毒力因子，在致病過程中發(fā)揮重要的作用。基于死亡率、發(fā)病率和病理學(xué)角度研究，SLY陽性豬鏈球菌2型菌株多被鑒定為高毒力豬鏈球菌菌株[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，SLY缺失株相較于野生株毒力顯著下降，幾乎不造成感染小鼠死亡[9]。豬鏈球菌感染可引發(fā)豬腦炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、流產(chǎn)等，其中腦炎是危害嚴(yán)重的疾病[15]。SLY在細(xì)菌性腦炎的發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用，有研究表明SLY高分泌菌株更容易誘發(fā)細(xì)菌性腦炎[10]。因而，選擇SLY作為篩選藥物靶點(diǎn)，從而選擇抑制劑，為治療和控制豬鏈球菌感染提供了一種新的思路和方法。

本研究以豬鏈球菌SLY作為作用靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)姜黃提取物對豬鏈球菌培養(yǎng)物上清的溶血活性具有顯著的抑制作用，并且對豬鏈球菌的生長不產(chǎn)生肉眼可見的影響，因而對豬鏈球菌不造成生存選擇壓力，但卻可以顯著抑制SLY的溶血活性，故而提示姜黃提取物是一種復(fù)合抗毒力策略的抗豬鏈球菌感染的天然先導(dǎo)化合物。進(jìn)一步通過體外細(xì)胞試驗(yàn)研究表明，姜黃提取物可以明顯抑制豬鏈球菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和透膜作用。綜上所述，姜黃提取物在不影響豬鏈球菌正常生長的前提下，可以直接抑制SLY的溶血活性，并且可保護(hù)緩解細(xì)菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性所造成細(xì)胞的死亡率，以及降低細(xì)菌的穿透細(xì)胞膜的能力，從而提示，姜黃提取物是以SLY為作用靶點(diǎn)的抗豬鏈球菌感染的天然先導(dǎo)化合物。