王紅寶，李紅麗，郭雪麗*，吉 濤，韓惠瑛

(1.山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032; 2.山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山西太原 030027)

禽流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1-2]。根據(jù)禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。低致病性禽流感雖然不會(huì)造成禽群的大規(guī)模死亡，但常常引起雞群輕度的呼吸道感染或產(chǎn)蛋率下降。禽流感病毒還能破壞免疫系統(tǒng)造成雞的免疫抑制，使雞群極易繼發(fā)其他疾病，導(dǎo)致體質(zhì)下降、病死率上升，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]，目前，規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)禽流感防疫效果還不盡如人意，雖然問題是多方面的，但疫苗毒株與地區(qū)流行毒株是否一致，是免疫成敗的關(guān)鍵所在。本文在已有研究的基礎(chǔ)上，選擇山西省主要養(yǎng)雞地區(qū)有代表性的和規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)的疑似病例喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺組織等樣品進(jìn)行禽流感病毒檢測(cè)，弄清當(dāng)?shù)氐闹饕餍卸局?，?duì)禽流感防控有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病料樣品采集 自2013年以來，在山西省運(yùn)城市、臨汾市、太原市、晉中市、忻州市、呂梁市、長(zhǎng)治市、晉城市及大同市等養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展較好的地市，將現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)與傳統(tǒng)流調(diào)模式相結(jié)合，建立了山西省規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)禽流感病毒監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，運(yùn)用流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)養(yǎng)雞場(chǎng)低致病性禽流感進(jìn)行全方位的監(jiān)測(cè)。采集病死或撲殺雞的喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺組織等，活禽靜脈采集血液、采集氣管拭子或泄殖腔拭子，雛禽采集新鮮的糞便(要求送檢的病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融)。各監(jiān)測(cè)點(diǎn)雞場(chǎng)共采集、處理、送檢疑似樣品608份，具體采樣地區(qū)見表1。

1.1.2 SPF雞胚和毒株 9日齡～11日齡SPF雞胚，由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；H1、H3、H9亞型禽流感AIV標(biāo)準(zhǔn)毒株由中科院微生物研究所提供。

1.1.3 主要試劑 RNA酶抑制劑、LATaq、DNA Marker聚合酶等，TaKaRa公司產(chǎn)品；Simply P Total RNA Extraction Kit，BioFlux公司產(chǎn)品；AMV，Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠等常規(guī)試劑均為分析純級(jí)。

表1 疑似低致病性禽流感的病料來源分布區(qū)

1.2 方法

1.2.1 樣品處理與培養(yǎng) 取采集的組織樣品放入研磨器中磨碎，加入PBS制成10%～20%的懸液，采集的拭子浸入2 mL～3 mL的PBS中，充分振蕩，反復(fù)擠壓，棄去拭子，在不超過25℃的室溫下1 000 r/min離心10 min～15 min，取上清液保存。全血樣品處理，待血凝后取血清保存在滅菌的1.5 mL離心管中，待進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

將處理后的樣品經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，經(jīng)無菌檢驗(yàn)為陰性后，接種9日齡～11日齡SPF雞胚，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，孵育至96 h，期間，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚。連續(xù)盲傳3代～5代。收集尿囊液按常規(guī)方法做血凝試驗(yàn)(HA)，然后分別用抗NDV、抗H1亞型、抗H3亞型、抗H9亞型的AIV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做血凝抑制試驗(yàn)(HI)。將血凝效價(jià)≥7log2的樣品進(jìn)行編號(hào)，分裝于1.5 mL離心管置-80℃保存，并進(jìn)行下一步RNA提取。

1.2.2 禽流感病毒總RNA的提取 取尿囊液病毒100 μL，采用Simply P Total RNA Extraction Kit提取樣品總RNA(按照說明書進(jìn)行)。提取后立即用于反轉(zhuǎn)錄或置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成禽流感病毒cDNA 以總RNA為模板，Radom Primer為引物，在AMV的作用下合成第1鏈cDNA。反應(yīng)體系為50 μL，在0.5 mL PCR反應(yīng)管中，先加入總RNA 10 μL，Radom Primer(10 pmol/μL)2 μL， AMV(10U/μL)2 μL，5×buffer 6 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL，DEPC處理水5 μL?；旌虾螅訙缇炗?0 μL。反應(yīng)條件為：25℃ 10 min，42℃ 90 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.2.4 PCR擴(kuò)增鑒定禽流感病毒 按本課題組建立的H1、H3、H9亞型三聯(lián)RT-PCR方法[7]進(jìn)行。PCR反應(yīng)的條件如下：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53℃ 50 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，以DL 2 000為Marker，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察所擴(kuò)增片段的大小，以鑒定所擴(kuò)增樣品是否是禽流感病毒。

根據(jù)GenBank登錄的H1、H3、H9亞型禽流感病毒基因序列，經(jīng)多序列比對(duì)，在保守區(qū)用 Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，TaKaRa公司合成，引物設(shè)計(jì)見表2。 PCR擴(kuò)增鑒定禽流感病毒具體反應(yīng)體系見表3。

表2 引物設(shè)計(jì)

表3 PCR擴(kuò)增AIV反應(yīng)體系

1.2.5 基因的克隆 將鑒定為陽性的樣品，用通用引物擴(kuò)增其全長(zhǎng)序列。通用反轉(zhuǎn)錄引物序列5′-AGCAAAAGCAGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析、回收純化后，連接T載體在4℃條件下過夜，次日轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中，涂于含有Amp抗性的LB平板，挑取單菌落，于180 r/min搖床，37℃培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.6 基因序列分析 應(yīng)用DNA Star7.1軟件對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，登錄GenBank中下載的序列進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

部分樣本PCR鑒定電泳圖見圖1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.H1、H3、H9亞型AIV；2～10.待檢樣品

M.DNA Marker DL 2 000；1.H1，H3，H9 subtypes of AIV；2-10.Detected samples

圖1三聯(lián)RT-PCR法檢測(cè)樣品電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of samples detected by triplex RT-PCR

由圖1可知，721 bp為H3亞型AIV出現(xiàn)的條帶，487 bp為H9亞型AIV出現(xiàn)的條帶，346 bp為H1亞型AIV出現(xiàn)的條帶。9份待檢樣品，其中8份都出現(xiàn)了487 bp的條帶，說明該樣品毒株均含H9亞型禽流感AIV。重復(fù)該試驗(yàn)，對(duì)各監(jiān)測(cè)點(diǎn)送檢的疑似樣品608份進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有68份禽流感病毒陽性，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，出現(xiàn)487 bp左右條帶的有65份，即判定該65份為H9亞型，其余3份樣品RT-PCR檢測(cè)沒條帶出現(xiàn)，即判定該3份樣品中不含H1、H3、H9亞型AIV。65份H9亞型發(fā)病地區(qū)分布情況及發(fā)病雞日齡分布情況見表4和表5。

表4 65份低致病性禽流感的病料來源分布

表5 65份低致病性禽流感發(fā)病雞日齡分布

由表4結(jié)果結(jié)合表1中病料采樣數(shù)計(jì)算可得，各地區(qū)疑似雞低致病性禽流感病料檢出率在太原地區(qū)為5.26%、大同地區(qū)為8.82%、晉城地區(qū)為6.78%、臨汾地區(qū)為13.04%、運(yùn)城地區(qū)為12.50%、晉中地區(qū)為9.88%、長(zhǎng)治地區(qū)為13.70%、忻州地區(qū)為11.59%、呂梁地區(qū)為13.25%。

由表5可知，雞低致病性禽流感的發(fā)病日齡主要在110日齡以上，60日齡～110日齡雞發(fā)病率較低，0～60日齡雞很少發(fā)病。

2.2 全長(zhǎng)血凝素(HA)基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)樣品進(jìn)行全長(zhǎng)血凝素(HA)基因RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出約為1 700 bp大小的特異性條帶，其長(zhǎng)度與預(yù)期相符合。擴(kuò)增結(jié)果電泳圖見圖2。

2.3 血凝素(HA)基因序列分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)序獲得樣品H9亞型AIV的HA基因的cDNA全序列，總長(zhǎng)度約為1 700 bp，包含了一個(gè)完整的開放讀碼框(ORF)。通過對(duì)血凝素(HA)基因的氨基酸序列分析，所測(cè)樣品的HA切割位點(diǎn)的序列均為RSSR ↓ GLF(335-334位)，切割位點(diǎn)附近無連續(xù)性堿基插入，符合低致病性禽流感病毒的特征。

2.4 血凝素(HA)基因cDNA序列同源性比較結(jié)果

經(jīng)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各樣品毒株間HA基因核苷酸序列同源性為96.5%～98.1%，其HA基因與我國(guó)現(xiàn)有疫苗的HA基因核苷酸及部分已分離鑒定毒株的序列同源性為88.9%～93.8%，說明HA基因已發(fā)生較大的遺傳漂變(表6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.H9亞型禽流感病毒

M.DNA Marker DL 2 000；1-4.H9 subtypes of AIV

圖2 全長(zhǎng)HA基因的PCR擴(kuò)增電泳圖

注：a連線(對(duì)角線)右上方為核苷酸序列同源性結(jié)果，左下方為核苷酸差異性結(jié)果。

Note：a line (diagonal) upper right is nucleotide sequence similarity result，the lower left is a nucleotide difference.

3 討論

從以上結(jié)果分析可知，山西省規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)流行的低致病性禽流感病毒主要為H9亞型AIV，在山西省的9個(gè)地區(qū)都有發(fā)病，主要是110日齡以上的蛋雞感染發(fā)病，雛雞和青年雞有零星出現(xiàn)。根據(jù)核苷酸序列同源性研究結(jié)果分析，山西主要流行的禽流感病病毒與目前市場(chǎng)上相關(guān)疫苗所用的毒株相比較，其HA基因已發(fā)生較大的遺傳漂變。

根據(jù)研究結(jié)果分析，各地區(qū)病料采樣疑似雞低致病性禽流感病料檢出率在5.26%～13.70%之間。檢出率比較高的地區(qū)為長(zhǎng)治、呂梁、臨汾、運(yùn)城等，這幾個(gè)地區(qū)養(yǎng)雞相對(duì)集中，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)附近小型養(yǎng)殖戶也比較多，造成低致病性禽流感的流行相對(duì)嚴(yán)重些；檢出率比較低的地區(qū)主要有太原、晉城、大同等，與這幾個(gè)地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)分布相對(duì)分散，養(yǎng)雞場(chǎng)附近小型養(yǎng)殖戶相對(duì)較少，雞場(chǎng)管理相對(duì)嚴(yán)格有很大關(guān)系。疑似病料的檢出率與病料采集人員的對(duì)雞低致病性禽流感發(fā)病癥狀的認(rèn)識(shí)水平也有著很大的關(guān)系。

本研究中初步分離鑒定出68份禽流感病毒，通過進(jìn)一步鑒定其中65份為H9亞型AIV，另外3份樣品毒株不屬于H1、H3、H9亞型禽流感，究竟屬于哪個(gè)亞型，有待今后研究。

本研究所采病料的養(yǎng)雞場(chǎng)對(duì)低致病性禽流感的防疫(只免H9亞型)通常是在雞45日齡～60日齡首免，100日齡～120日齡二免，300日齡～350日齡加強(qiáng)免疫。2008年，謝海燕等[8]報(bào)道了禽流感疫苗對(duì)采集活禽泄殖腔、喉拭子樣品中禽流感病毒PCR檢測(cè)結(jié)果的無影響。本研究采集的是疑似禽流感發(fā)病雞的病料，對(duì)PCR檢測(cè)發(fā)病病原的診斷結(jié)果應(yīng)該沒有明顯影響，有待進(jìn)一步研究證明。

依據(jù)禽流感病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，禽流感病毒有許多亞型?，F(xiàn)已鑒定出HA亞型有15個(gè)(H1～H15)，NA亞型9個(gè)(N1～N9)。低致病性禽流感病毒主要是H1、H3、H9亞型，而H5、H7亞型具有高度的致病力。據(jù)報(bào)道，全球超過90%的H9N2病毒株來自亞洲，其中72%左右來自中國(guó)[9]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)人感染H7N9和H10N8禽流感病毒部分內(nèi)部基因均來自H9亞型病毒[10]。由此可見，無論是高致病性禽流感病毒還是低致病性禽流感病毒，都對(duì)人們的健康和生命安全產(chǎn)生了危害。我國(guó)是世界上家禽養(yǎng)殖大國(guó)，禽流感的檢測(cè)和防控已經(jīng)成為不可忽視的民生問題[11-14]。H9N2亞型禽流感病毒在我國(guó)不但廣泛存在，而且變異迅速，由最先出現(xiàn)和流行的BJ/94-like到G1-like、G9-like、Y439-like、Y280-like毒株，經(jīng)歷20年時(shí)間，目前我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒至少存在75種基因型，且不斷有新變異毒株和基因型的出現(xiàn)[15-17]。弄清山西低致病性禽流感的流行毒株情況，對(duì)當(dāng)?shù)厍萘鞲械姆揽赜惺种匾囊饬x。