周丹娜，李文浩，阮 征,劉 威，郭 銳，楊克禮,段正贏,袁芳艷,劉澤文,陳文杰，孟 麗，焦祖武*，田永祥*

(1.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北武漢 430064；3.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,湖北武漢 430016)

流產(chǎn)衣原體(Chlamydophilaabortus,C.abortus)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原微生物，可以導(dǎo)致宿主的結(jié)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎及腸炎等疾病，孕婦和懷孕母畜都十分容易被感染并引起流產(chǎn)或發(fā)生死胎[1]。流產(chǎn)衣原體不僅對人類的生命帶來了嚴(yán)重的威脅，而且還給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)危害[2]。對全國不同地區(qū)的豬場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)豬流產(chǎn)衣原體血清抗體陽性檢出率普遍偏高[3]。使用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行C.abortus的檢測比較繁瑣，而且極易造成污染導(dǎo)致結(jié)果無效或虛假陰陽性，難以滿足臨床檢測需要。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的成熟，諸如RT-PCR、套式PCR、雙重PCR等多種方法被廣泛應(yīng)用于衣原體的病原檢測，提高了衣原體檢測的準(zhǔn)確性和敏感性，但難以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控及定量分析。本研究構(gòu)建C.abortusmomp基因的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，通過軟件進(jìn)行基因編碼序列分析并設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針(5′-FAM、3′-Dabycl)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，擬建立C.abortus實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株、病毒C.abortusHB1043株、E.coliDH5α、Mycoplasma、C.suis、C.pneumoniae、PRRSV基因組，均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，愛思進(jìn)(杭州)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； MiniBEST universal genomic DNA extraction kit ver.5.0試劑盒、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、10×T buffer、rTaq酶、dNTP Mix、DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×Phanta EVO HS Master Mix高保真酶、2×TaqMaster Mix PCR預(yù)混液，諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；GeneCopoeia All-in-OneTMqPCR Mix，復(fù)能基因生物科技有限公司產(chǎn)品；STEPONE plus熒光定量PCR儀、Stepone2.2軟件，美國LIFE科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的C.abortusHB1043株momp全基因序列(JN411078)，利用DNA Man 8.0和Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針(表1)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物和探針信息

1.2 方法

1.2.1 豬流產(chǎn)衣原體陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒從C.abortusHB1043株陽性卵黃膜液中抽提其DNA，以其為模板，利用ecp-momp和ecp-momp2引物[4]，進(jìn)行C.abortusmomp基因全長的擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pMD18-T隆載體上并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，用含有氨芐青霉素抗性的LA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌液PCR篩選陽性克隆，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。提取陽鑒定無誤的陽性質(zhì)粒，利用紫外分光光度計(jì)測其濃度和純度，計(jì)算出質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的確立 以構(gòu)建的MOMP-T陽性質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)中將探針濃度分別設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L 7個(gè)梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定探針最佳反應(yīng)濃度后，在引物優(yōu)化反應(yīng)中所采取的引物濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 、0.25 、0.30、0.35 μmol/L 7個(gè)濃度，確定好引物及探針的最佳反應(yīng)濃度后，進(jìn)行Tm值優(yōu)化，選取溫度梯度范圍為50.0、51.1、52.8、55.3、58.9、61.5、63.1、64.0℃共8個(gè)梯度。通過確立最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)條件以達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行8個(gè)梯度的倍比稀釋，從1×100拷貝/μL ～1×107拷貝/μL，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增，記錄Ct值和循環(huán)數(shù)，通過計(jì)算以Ct值為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R和擴(kuò)增效率，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)。選用模板分別是流產(chǎn)衣原體DNA、MOMP-T質(zhì)粒、豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及日本腦炎病毒(JEV)的核酸進(jìn)行特異性試驗(yàn)，同時(shí)各設(shè)置1孔陰性對照和空白對照。根據(jù)PCR反應(yīng)曲線和Ct值確定該檢測方法的特異性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn) 使用分光光度計(jì)對衣原體重組質(zhì)粒的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度的測定，同時(shí)結(jié)合OD 260 nm/OD 280nm比值，計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，其計(jì)算公式：陽性重組質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=(6.02×1023×稀釋倍數(shù)×質(zhì)粒濃度×10-9)/(660 Da×質(zhì)粒堿基長度)。經(jīng)計(jì)算將陽性質(zhì)粒濃度為進(jìn)行1.0×1012拷貝/μL 10倍稀釋(1.0×1012-1.0拷貝/μL)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以Ct值<35為下限判定其靈敏度。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn) 將MOMP-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，從1×106拷貝/μL～1×104拷貝/μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，通過計(jì)算每個(gè)稀釋度Ct值和拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來驗(yàn)證該方法的批內(nèi)重復(fù)性。在3個(gè)不同的時(shí)間檢測保存于-20℃的3個(gè)濃度的MOMP-T質(zhì)粒樣品，來驗(yàn)證模板的穩(wěn)定性及熒光定量PCR的批間重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測 采用本研究建立的方法對2個(gè)豬場采集的30份樣品提取核酸進(jìn)行檢測，并對real-time PCR檢測為陽性的樣品進(jìn)行16 S/23 S rRNA擴(kuò)增及測序[5]，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備結(jié)果

用CA-momp-F/R引物對MOMP-T進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增片段與預(yù)測的目的片段大小251 bp相一致(圖1)，初步判定重組的質(zhì)粒是陽性。將C.abortus質(zhì)粒MOMP-T的測序結(jié)果分別與GenBank中已登錄的momp基因序列比對，BLAST結(jié)果顯示，C.abortus的質(zhì)粒MOMP-T序列與GenBank中登錄的序列同源性為94%。純化后的質(zhì)粒DNA濃度為1.0×1012拷貝/μL，OD 260 nm/OD 280nm為1.96。說明構(gòu)建的C.abortus陽性質(zhì)粒的純度比較高，能滿足試驗(yàn)檢測要求。將其稀釋成1×100拷貝/μL ～1×107拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和體系的確立

通過動(dòng)力學(xué)曲線和擴(kuò)增效率判斷優(yōu)化的結(jié)果，最終反應(yīng)體系為20 μL，包括2×OneTMqPCR Mix 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL、滅菌去離子水7.8 μL、模板1 μL；其反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 10 s，55.3℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；4℃結(jié)束反應(yīng)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.MOMP-T質(zhì)粒；2.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1.MOMP-T；2.Negative control

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建結(jié)果

將流產(chǎn)衣原體陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋8個(gè)梯度100～107拷貝/μL，使用本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以Ct值為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制稀釋后拷貝數(shù)100拷貝/μL～107拷貝/μL對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，R=0.993 2，方程式為y=-0.289 4x+12.762，擴(kuò)增效率為94.7%。由此可見本檢測體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率高,熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間相關(guān)性好,準(zhǔn)確性高。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

C.abortus特異性試驗(yàn)鑒定所使用的DNA有流產(chǎn)衣原體、陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品MOMP-T、豬肺炎支原體、豬衣原體、肺炎衣原體和豬藍(lán)耳病病毒。經(jīng)過熒光定量PCR擴(kuò)增后，結(jié)果僅C.abortus的DNA和陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品MOMP-T DNA有擴(kuò)增曲線，其余均沒有擴(kuò)增曲線(圖3)，表明該檢測方法良好的特異性。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

將MOMP-T質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋，應(yīng)用優(yōu)化后的各條件所建立的方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果顯示C.abortus實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為1.0拷貝/μL(圖4)，由于嗜衣原體基因組內(nèi)的MOMP基因是單拷貝基因[4]，因此衣原體模板的分子數(shù)可推算為10 fg DNA相當(dāng)于1個(gè)拷貝的基因[6]，證明方法具有較高的敏感性。

1.流產(chǎn)衣原體；2.陽性質(zhì)粒對照；3.支原體；4.豬衣原體；5.肺炎衣原體；6.藍(lán)耳病毒；7.陰性對照；8.空白對照

1.C.abortu；2.C.abortuMOMP-T；3.Mycoplasma；4.C.suis；5.C.pneumoniae；6.PRRSV；7.Negative control；8.Blank control

圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 Specificity test results of real-time PCR

1～12.1.0×1012拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL；13.陰性對照；14.空白對照

1-12. 1.0×1012copies/μL-1.0×100copies/μL，respectively；13.Negative control；14.Blank control

圖4實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

Fig.4 Sensitivity test results of real-time PCR

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將MOMP-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取濃度范圍在109拷貝/μL～107拷貝/μL這3個(gè)稀釋梯度的質(zhì)粒，每個(gè)梯度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)n(n≥3)次數(shù)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。其結(jié)果顯示其批內(nèi)與批間的變異系數(shù)為0.022%～0.051%(表2)，說明所建立的檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的方法對30份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，檢出流產(chǎn)衣原體6份，陽性檢出率20%，將檢出的陽性樣品進(jìn)行16 S/23 S rRNA擴(kuò)增及測序，BLAST結(jié)果顯示6份陽性樣品中的病原與豬源流產(chǎn)衣原體同源性為100%。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

最新的分類方法將衣原體目(Chlamydiales)下設(shè)8個(gè)科、11個(gè)屬，其中與人或動(dòng)物衣原體病相關(guān)的衣原體主要?dú)w類到衣原體科(Chlamydiaceae)，該科有一個(gè)衣原體屬(Chlamydia)，包含了12個(gè)衣原體種，C.abortus就是其中一種[7-8]。流產(chǎn)衣原體宿主范圍廣，可造成豬、馬、牛、羊等家畜的流產(chǎn)、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病，并可由動(dòng)物傳染給人，導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患疫病[9]。由于衣原體常與其他病原混合感染，并未引起足夠的關(guān)注，血清學(xué)調(diào)查顯示，不同動(dòng)物衣原體陽性率在26.12%～35.41%，是某些地區(qū)山羊等家畜流產(chǎn)的主要原因之一[10-12]。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速的診斷方法是控制該病的關(guān)鍵。

早期人們對衣原體的研究都是通過簡單的顯微鏡鏡檢等靈敏度不高的傳統(tǒng)方法，隨著科學(xué)儀器不斷更新，PCR為基礎(chǔ)的各種病原檢測方法得到了越來越廣泛的應(yīng)用。流產(chǎn)衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立，首先是要對流產(chǎn)衣原體的保守基因編碼序列區(qū)域進(jìn)行比對分析，然后確定特異性引物和對應(yīng)特異性探針的最佳保守結(jié)合位點(diǎn)，16 S rRNA因其保守性極佳，是理想的目的基因，但很難區(qū)分豬流產(chǎn)衣原體和其他衣原體，特別是鸚鵡熱衣原體。歐洲不同國家C.abortus分離株基因組進(jìn)化分析結(jié)果顯示，其基因多樣性要遠(yuǎn)低于其他種屬內(nèi)，并具有很強(qiáng)的地理特征[12]。momp基因保守且屬間特異性強(qiáng)，可用于不同屬衣原體的鑒別診斷[13]。因此，本研究選取momp基因建立了豬流產(chǎn)衣原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，與袁曾壯[14]、馮悅等[15]建立的衣原體TaqMan-MGB探針熒光定量PCR相比，本研究建立的檢測方法線性相關(guān)系數(shù)R2和擴(kuò)增效率略低于MGB探針，但變異系數(shù)范圍比較小，綜合比對數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，本研究建立的分子信標(biāo)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較高，特異性好，分子標(biāo)記探針成本較MGB探針相對便宜，具有很好的應(yīng)用前景。