吳 陽,李 強,徐紅偉,喬磊磊,李袁澤,薛 萐,

(1.西北農(nóng)林科技大學 資源環(huán)境學院,陜西 楊凌712100; 2.榆林學院 陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復重點實驗室,陜西 榆林719000; 3.中國科學院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌712100; 4.西北農(nóng)林科技大學 水土保持研究所,陜西 楊凌712100; 5.西北農(nóng)林科技大學 林學院,陜西 楊凌712100)

從上個世紀中葉開始，由于礦物燃料燃燒，含氮化肥生產(chǎn)和使用及畜牧業(yè)等人類的活動[1]，大大的增加了進入陸地和水生系統(tǒng)的活性N的數(shù)量[2-3]。過量的N輸入會改變土壤有機質的分解，影響土壤團聚體結構和土壤體積密度，從而改變土壤理化性質和自然結構[4-6]。氮是植物生長的限制性因子，氮的過多輸入勢必會影響植物的生長，與此同時，也會影響與其共生的AM真菌的生長[7-14]。

叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)是土壤中重要的微生物群落之一[15]。普遍存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)中，研究表明80%以上的陸生維管束植物具有叢枝菌根[16]。AMF作為橋梁，連接土壤和植物的根，在植物營養(yǎng)中扮演著重要的角色[17]。AMF可以通過增加宿主植物對礦物質元素的吸收和循環(huán)，從而促進植物的生長[18-19]。還可以提高植物耐受脅迫的能力，提高植物對干旱和病原體的抗性[20-21]，以及提供營養(yǎng)種間轉移的途徑，改善土壤水分，土壤結構等[16]。球囊霉素或者球囊霉素相關蛋白(glomalin-related soil protein，GRSP)，是AMF真菌分泌的一種疏水性蛋白，目前根據(jù)Wright[22]提取法可將其分為總球囊霉素(Total glomalin，T-GRSP)和易提取球囊霉素(Easily ex-tractable glomalin，EE-GRSP)。球囊霉素作為土壤有機碳，氮的重要來源[23]，被稱為“超級膠水”的它，可以極大地提高、改善土壤顆粒的穩(wěn)定性[24]，改善土壤有機結構和土壤特性[25]，提高土壤有機碳的固定能力[26]。土壤GRSP質量的變化還可以作為改善流域管理和保護水生生態(tài)系統(tǒng)的指標[27]。所以，土壤GRSP對于土地質量的改善，評價以及指示土壤碳庫的變化具有重要的意義。

關于GRSP分別在農(nóng)田、針葉林、沙漠、溫帶森林、溫帶草地以及熱帶雨林都有研究[28]。另外，不同的土地利用方式[29-31]以及施肥方式[32-33]對土壤GRSP的也具有顯著的影響。N沉降作為目前非常普遍的一種環(huán)境變化[4-6,34-35]，然而目前針對氮沉降對土壤GRSP含量的影響研究相對較少，且還沒有一致的結論。因此，本研究以黃土高原典型地帶性植物白羊草(Bothriochloaischaemum)為研究對象，采用小車控制試驗，通過氮添加模擬氮沉降對GRSP的影響，旨在揭示未來全球變化背景下，土壤生態(tài)過程的響應機制，為區(qū)域生態(tài)建設提供科學依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗地點介紹

小車模擬小區(qū)試驗設在陜西省楊凌區(qū)(108°4′27.95″E，34°16′56.24″N)西北農(nóng)林科技大學水土保持研究所內。日平均氣溫13.2℃，平均降水量674.3 mm，日照1 993.7 h，無霜期225 d，屬溫帶大陸性季風氣候。

1.2 試驗設計和樣品采集

試驗采用自制移動變坡式土槽，尺寸規(guī)格為：長×寬×高=2.0 m×1.0 m×0.5 m，試驗用白羊草種子采自陜西省安塞縣(109°14′E，36°92′N)，供試土壤采自陜西省安塞縣表層黃綿土(0—20 cm)，土壤容重控制在1.2 g/m3左右，分四層裝土，每層10 cm，填土總高度40 cm，試驗坡度為15°。按照密度10 cm×10 cm，深度0.5 cm種植白羊草，模擬白羊草純群落。試驗期間，除拔掉雜草外，不做任何人工處理。根據(jù)全球N沉降水平和發(fā)展趨勢，試驗設4個水平，5個處理，每個處理3個重復，裸地(LD)既無植被也不進行氮添加處理，對照CK(0 g/m2)、N1(2.5 g/m2)、N2(5 g/m2)和N3(10 g/m2)有植被且按照試驗設計濃度進行氮添加處理，4個水平氮添加參考目前全球N沉降濃度設計[36]，氮肥為尿素(CO(NH2)2)。

本試驗設計為兩年、2013年份氮添加在2013年8月份一次性施入，2014年份氮添加在白羊草生長季(5月—8月)進行，每月添加一次，添加量為全年施氮水平的四分之一。施氮方法為：將尿素充分溶解在1 L水中，于雨前均勻噴撒到試驗小車內，裸地(LD)及對照組(CK)只噴灑相同體積的水。將小車置于室外培育，不做任何處理。取樣于2014年9月底進行，方法為：在小車內隨機選取6個10 cm×10 cm×10 cm 的樣方，剔除根系，土壤混勻后過1 mm篩并風干備用，用于土壤基本指標和GRSP含量的測定。

土壤基本理化性質采用常規(guī)方法[37]測定：土壤有機碳(Soil organic carbon，SOC)用重鉻酸鉀氧化—外加熱法；土壤全氮(Total N)采用凱氏定氮法；土壤全磷(Total P)采用硫酸—高氯酸消煮，鉬銻抗比色法測定；土壤硝態(tài)氮用水浸提，采用紫外分光光度法測定；土壤銨態(tài)氮用水浸提，采用連續(xù)流動分析儀測定；pH值用pH計測定(水∶土=2.5∶1)；土壤速效磷(Available P)采用碳酸氫鈉提取鉬銻抗比色法測定。

GRSP含量的測定分為兩個部分：浸提是按照Wright和Upadahyaya[24]提出的方法。(1) 易提取球囊霉素相關土壤蛋白(EE-GRSP)浸提：稱取供試土樣1.00 g，加入8 ml 20 mmol/L， pH值為7.0的檸檬酸鈉溶液，121℃條件下浸提30 min，立即將浸提液以10 000 rpm離心5 min，然后將上清液倒入10 ml離心管中，保存于4℃冰箱中備用。(2) 總球囊霉素相關土壤蛋白(T-GRSP)浸提：稱取供試土樣1.00 g，加入8 ml 50 mmol/L，pH值為8.0的檸檬酸鈉溶液，121℃條件下浸提60 min，隨即將浸提液以10 000 rpm離心5 min后，將上清液倒入50 ml離心管中，補充等體積的浸提液，繼續(xù)浸提，浸提6次。合并所有浸提液，保存于4℃下待測。濃度測定采用考馬斯亮藍測定蛋白質的方法：取浸提液1 ml于10 ml離心管，加入5 ml考馬斯亮藍,顯色2 min后于595 nm下比色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進行整理分析，用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用Canoco 5.0進行冗余分析(RDA)。

2 結果與分析

2.1 氮添加對土壤基本理化性質的影響

在CK和LD相比，土壤有機碳、全氮以及全磷含量均有所升高，但無顯著性差異。硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效磷含量降低，但硝態(tài)氮未達到顯著水平。和CK相比，不同濃度氮添加后土壤全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和全磷含量均呈增加趨勢，其中銨態(tài)氮有顯著差異，硝態(tài)氮無顯著差異，全氮和全磷在N3達到顯著水平。土壤有機碳先升高后降低，但均未達到顯著水平。速效磷和pH值隨著N濃度升高逐漸降低，其中速效磷在N1達到顯著水平，pH值則未有顯著差異(表1)。

表1 土壤基本理化性質

注：不同小寫字母表示不同處理之下同一指標有顯著差異(p<0.05)。

2.2 N添加對土壤GRSP含量的影響

CK和LD相比，T-GRSP，EE-GRSP含量均降低，但都未達到顯著水平。隨著氮添加濃度增加，土壤中T-GRSP含量總體上呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，在N1時濃度最高，但差異不顯著(p<0.05)(圖1所示)。其中EE-GRSP含量與CK相比，在N3時降低達到顯著性水平，其余處理均無顯著性差異(p<0.05)。

N沉降作為21世紀新近出現(xiàn)的環(huán)境問題，所引起的一系列的生態(tài)環(huán)境變化，已經(jīng)日益引起人們的關注[38]。但是，N沉降對土壤GRSP含量的影響在國內外研究較少[35]。Treseder等在對27個生態(tài)系統(tǒng)的球囊霉素含量的文獻調查顯示：N，P的添加對土壤中球囊霉素含量的變化沒有影響[28]。Wuest等通過對種植冬小麥的土壤進行不同濃度的N(0，45，90 kg/hm2)添加，也得出了相同的結論，即N添加對土壤GRSP含量的變化并無顯著的差異[34]。以上研究均和本試驗結果類似，N添加對土壤GRSP的含量變化并無顯著性影響。GRSP是AM真菌分泌的一種含鐵的特殊蛋白物質[22]。張驕陽等研究了在相同處理下土壤微生物群落結構的變化規(guī)律，結果顯示真菌PLFA含量變化先增加后降低，且在N1時達到最大[39]，呂鳳蓮在對油松根際土微生物群落研究中，設置了0，2.8，5.6，11.2，22.4 g N/(m2·a)共5種N添加濃度后得出：AMF的豐度隨著N添加濃度先升高然后在降低[14]，走向均和本試驗GRSP類似。所以出現(xiàn)GPRS的含量沒有顯著變化可能的原因是：最初的N添加，并沒有改變AM真菌的豐度[35]。然而在本研究中，EE-GRSP在N3時顯著性降低，所以當N添加達到一定濃度后，會抑制AMF的生長，從而降低土壤GRSP的濃度。但是GRSP和AMF之間的作用機制，還有待進一步研究[32]。

2.3 土壤GRSP含量的冗余分析

對土壤T-GRSP，EE-GRSP和土壤全氮、全磷、有機碳、速效磷、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、pH值，C/N以及地上和地下生物量10個環(huán)境因子進行冗余分析(RDA)，由于考慮到生物量因素，我們此處并未對LD進行分析，表明：RDA1和RDA2分別解釋了97.00%和2.64%的變化，10種環(huán)境因子共同解釋了99.64%的GRSP含量變化。SOC，C/N與EE-GRSP呈顯著正相關，是影響其的主要因素，地上、地下生物量、SOC，C/N和銨態(tài)氮與T-GRSP呈顯著正相關，全磷與T-GRSP和EE-GRSP皆呈顯著負相關(圖2)。

以上結果表明土壤C/N，SOC對土壤GRSP含量影響顯著，這和前人研究結果基本吻合。1998年，Wright和Upadhyaya發(fā)現(xiàn)了37種不同土壤的GRSP和SOC含量變化呈現(xiàn)顯著相關性[40]。Riling[41]、Jing Zhang[26，35]和杜介方[32]等也發(fā)現(xiàn)了二者呈現(xiàn)顯著的相關性，其結果都和本試驗相似。Riling等發(fā)現(xiàn)在AMF的菌絲生長時，SOC是影響GRSP生成的主要因素[42]。Jing Zhang等在對中國南部的人工林，次生林和原始森林土壤中GRSP和SOC的13C進行NMR分析結果得出：GRSP中烷基C和芳香族C的總和與O-烷基C和羧基C的總和之比的值明顯高于SOC中的值，說明：GRSP含有豐富的烷基C和芳香族C，這些特殊的結構可以調節(jié)SOC的固定[26]。GRSP的平均壽命大概為6～42 a[42]，其作為土壤C庫的重要組成部分，在一定程度上可以反映土壤C庫的變化情況[42]。所以研究土壤GRSP和SOC之間的含量變化對土壤質量以及管理具有重要的意義。

注：不同小寫字母表示不同處理之下同一指標有顯著差異(P<0.05)。

圖1不同的N添加對土壤T-GRSP和EE-GRSP含量的影響

圖2 GRSP含量和環(huán)境因子的冗余分析

3 結 論

在經(jīng)過不同濃度N1(2.5 g/m2)、N2(5 g/m2)和N3(10 g/m2)添加后，以裸地(LD)和不進行氮添加處理CK(0 g/m2)為對照，土壤中T-GRSP含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但變化未達到顯著水平，而土壤EE-GRSP的含量變化在N3時顯著降低(p<0.05)。冗余分析表明：SOC，C/N是影響土壤GRSP的主要因素。由于本實驗室為人工控制下進行的培養(yǎng)試驗，且試驗周期較短，因此很難從機理上揭示氮添加對GRSP的作用機制，因此在下一階段需要加強此方面的工作，特別是氮添加后AMF和GRSP之間的作用關系研究。