高 楓 沈 娟 楊彥玲

(延安大學醫(yī)學院，延安716000)

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的細胞，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)可發(fā)揮重要作用，且影響多種疾病發(fā)生的病理過程[1]。研究顯示，在多種缺氧導致的腦損傷疾病中，星形膠質(zhì)細胞的增殖和活化明顯增強，這提示星形膠質(zhì)細胞可影響缺氧誘導的腦損傷的發(fā)生發(fā)展[2]。姜黃素是一種從姜黃等植物根莖中提取出來的天然有效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎等多種生物活性，對神經(jīng)有良好的保護作用[3]。有研究顯示，姜黃素能使海馬神經(jīng)元分化增強[4]；可降低顱腦損傷后神經(jīng)元細胞凋亡及炎癥反應，從而對神經(jīng)起到保護作用[5]；可增加丙烯腈誘導的星形膠質(zhì)細胞活力及降低LDH的釋放而對細胞損傷起保護作用[6]。但姜黃素對缺氧誘導的星形膠質(zhì)細胞活力及凋亡影響機制還未清楚。因此，本研究檢測姜黃素對缺氧誘導的星形膠質(zhì)細胞活力及凋亡的影響，并進一步研究可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 新生2 d的SPF級Wistar大鼠，雌雄不限，共24只，購自延安動物中心；MTT試劑購自美國Gibco；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；AG490購自美國BioLegend公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(Phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2)及磷酸化的信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體購自美國Abcam公司；酶標儀和流式細胞儀均購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及分組 分離出大鼠大腦皮層，剪碎消化后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，20%O2孵育箱中培養(yǎng)1 h，細胞懸液重新種植于已事先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，每兩天細胞換液一次，待瓶底長滿95%細胞進行傳代，取第三代成熟純化的星形膠質(zhì)細胞用于實驗研究。

1.2.2細胞分組及缺氧處理 星形膠質(zhì)細胞分為對照組、缺氧組和缺氧+姜黃素組。對照組在37℃和5%體積分數(shù)的CO2及95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧組進行一次換液后在4%體積分數(shù)的O2、5%體積分數(shù)的CO2及91%體積分數(shù)的N2混合氣體中培養(yǎng)，缺氧+姜黃素組細胞換液后加入10 μmol/L姜黃素培養(yǎng)1 h后再在缺氧混合氣體中培養(yǎng)。

1.2.3各組細胞活力檢測 通過MTT法檢測各組細胞活力。收集缺氧處理24 h的細胞，每孔細胞中加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入100 μl的DMSO，充分震蕩混勻15 min，酶標儀于570 nm波長測定各組的吸光度值(OD值)，取均值。以OD值反映細胞活力，可間接反映出細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.2.4各組細胞凋亡檢測 細胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測。收集缺氧處理24 h的細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，胰酶消化細胞，制備成單細胞懸液。避光冰上加入Annexin V-FITC和PI的稀釋液各5 μl，充分混勻，室溫避光培養(yǎng)10 min，再加入400 μl冷卻的結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)上流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數(shù)，觀察各組細胞的凋亡百分比。實驗重復3次。

1.2.5姜黃素對Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達的影響 細胞中加入裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每孔道加入40 μg蛋白，行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉后4℃孵育一抗過夜，一抗Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3均1∶500稀釋，內(nèi)參GAPDH按照1∶1 000稀釋，洗膜。加入1∶10 000 稀釋的二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)，洗膜，室溫水平搖床搖動孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析。

1.2.6抑制JAK2/STAT3信號通路對細胞活力及凋亡的影響 星形膠質(zhì)細胞分為缺氧+姜黃素組和缺氧+姜黃素組+AG490組(JAK2/STAT3信號通路抑制劑)，其中AG490的劑量為10 mol/L，細胞培養(yǎng)24 h，通過CCK8法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot檢測Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞活力的影響 MTT法檢測姜黃素對缺氧誘導的大鼠星型膠質(zhì)細胞活力的影響，結(jié)果如表1所示，缺氧組細胞活力顯著高于對照組(t=8.593，P=0.000)，而缺氧+姜黃素組細胞活力顯著低于缺氧組(t=4.930，P=0.003)。

2.2姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀檢測姜黃素對缺氧誘導的大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡的影響，結(jié)果如圖1和表2所示，缺氧組細胞凋亡率顯著高于對照組(t=9.756，P=0.000)，而缺氧+姜黃素組細胞凋亡率顯著低于缺氧組(t=4.429，P=0.004)。

表1姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞的影響

Tab.1Effectofcurcuminonastrocytesinrats

GroupsODControl group0.326±0.042Hypoxia group0.692±0.0641)Hypoxia+curcumin group0.482±0.0482)F37.186P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

2.3姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號通路的影響 通過Western blot檢測Bcl-2家族抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和JAK2/STAT3信號通路p-JAK2及p-STAT3的蛋白表達，結(jié)果如圖2和表3所示，與對照組比較，缺氧組Bcl-2蛋白表達顯著降低(tBcl-2=11.764，PBcl-2=0.000)，Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達顯著升高(tBax=10.396，PBax=0.000；tp-JAK2=15.409，Pp-JAK2=0.000；tp-STAT3=13.221，Pp-STAT3=0.000)；與缺氧組比較，缺氧+姜黃素組Bcl-2蛋白表達顯著升高(tBcl-2=6.171，PBcl-2=0.001)，Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達顯著降低(tBax=4.877，PBax=0.003；tp-JAK2=9.575，Pp-JAK2=0.000；tp-STAT3=6.611，Pp-STAT3=0.001)。

表2姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡的影響

Tab.2Effectofcurcuminonapoptosisofratastrocytes

GroupsApoptosis rate(%)Control group1.47±0.23Hypoxia group6.47±0.871)Hypoxia+curcumin group4.20±0.612)F47.727P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

2.4抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞活力及凋亡的影響 MTT及流式細胞儀分別檢測姜黃素及姜黃素和JAK2/STAT3信號通路抑制劑AG490聯(lián)合對缺氧誘導的大鼠星型膠質(zhì)細胞活力及凋亡的影響，結(jié)果如圖3和表4所示，與缺氧+姜黃素組比較，缺氧+姜黃素+AG490組細胞活力顯著降低(t=4.461，P=0.011)，細胞凋亡率顯著降低(t=5.747，P=0.005)。

2.5抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號通路的影響 缺氧+姜黃素組和缺氧+姜黃素+AG490組Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達結(jié)果如圖4和表5所示，缺氧+姜黃素+AG490組Bcl-2蛋白表達顯著高于缺氧+姜黃素組(tBcl-2=9.420，PBcl-2=0.001)，Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達顯著低于缺氧+姜黃素組(tBax=6.851，PBax=0.002；tp-JAK2=10.392，Pp-JAK2=0.001；tp-STAT3=8.441，Pp-STAT3=0.001)。

圖2 姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達的影響Fig.2 Effect of curcumin on expression of Bcl-2,Bax,p-JAK2 and p-STAT3 protein in rat astrocytesNote: 1.Control group;2.Hypoxia group;3.Hypoxia + curcumin group.

表3姜黃素對大鼠星型膠質(zhì)細胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達的影響

Tab.3EffectofcurcuminonexpressionofBcl-2,Bax,p-JAK2andp-STAT3proteininratastrocytes

GroupsProtein relative expressionBcl-2Baxp-JAK2p-STAT3Control group0.388±0.0450.114±0.0180.021±0.0080.039±0.007Hypoxia group0.083±0.0101)0.421±0.0481)0.367±0.0421)0.251±0.0281)Hypoxia+curcumin group0.243±0.0302)0.277±0.0362)0.152±0.0212)0.145±0.0182)F69.24854.112121.04687.402P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the hypoxia group,2)P<0.05.

圖3 抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway on apoptosis of rat astrocytes

表4抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞活力及凋亡率的影響

Tab.4EffectofinhibitionofJAK2/STAT3signalingpathwayonviabilityandapoptosisrateofastrocytesinrats

GroupsODApoptosis rate(%)Hypoxia+curcumin group0.523±0.0514.15±0.57Hypoxia+curcumin+AG490 group0.302±0.0691)2.23±0.401)

Note：Compared with the hypoxia+ curcumin group,1)P<0.05.

表5抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達的影響

Tab.5EffectofinhibitionofJAK2/STAT3signalingpathwayonexpressionofBcl-2,Bax,p-JAK2andp-STAT3proteininratastrocytes

GroupsProtein relative expressionBcl-2Baxp-JAK2p-STAT3Hypoxia+curcumin group 0.178±0.0210.258±0.0290.121±0.0120.237±0.032Hypoxia+curcumin+AG490 group0.534±0.0621)0.127±0.0161)0.031±0.0091)0.075±0.0091)

Note：Compared with the hypoxia+ curcumin group,1)P<0.05.

圖4 抑制JAK2/STAT3信號通路對大鼠星型膠質(zhì)細胞Bcl-2、Bax、p-JAK2及p-STAT3蛋白表達的影響Fig.4 Effect of inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway on expression of Bcl-2,Bax,p-JAK2 and p-STAT3 protein in rat astrocytesNote: 1.Hypoxia+ curcumin group;2.Hypoxia+ curcumin+AG490 group.

3 討論

星形膠質(zhì)細胞在大腦中有廣泛分布，維持大腦的穩(wěn)態(tài)，對大腦有保護作用，而在缺氧條件下星形膠質(zhì)細胞活性升高，影響腦損傷的發(fā)生及發(fā)展[7]。姜黃素是常用的中藥姜黃的有效成分，有多種藥理作用，如抗凋亡、抗炎、抗氧化等，有很高的應用價值。研究顯示，姜黃素可通過降低免疫因子TNF-α、IL-6釋放而抑制LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞炎癥反應[8]；姜黃素可抑制TNF-α誘導后星形膠質(zhì)細胞單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達[10]；姜黃素可通過下調(diào)NF-κb信號降低星形膠質(zhì)細胞的活化[9]。姜黃素對缺氧誘導的星形膠質(zhì)細胞活力及凋亡影響還未明確。有研究顯示，4、10、20、40、80 μmol/L的姜黃素均可降低正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞活力，40、80 μmol/L的姜黃素的抑制率分別為81.8%和40.6%，因此，本研究選擇10 μmol/L的姜黃素作為實驗濃度。

通過姜黃素處理缺氧誘導的星形膠質(zhì)細胞，MTT及流式細胞儀分別檢測細胞活力及凋亡率，結(jié)果顯示，缺氧可提高細胞的活力及凋亡率，而姜黃素可緩解這一效應。細胞凋亡受到Bcl-2家族的調(diào)控，Bcl-2家族有促凋亡及抑凋亡蛋白，Bcl-2為抑凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白，細胞凋亡由兩者比例決定，Bcl-2表達降低，而Bax表達升高則促進細胞凋亡，反之則抑制細胞凋亡[11-14]。有研究顯示，星形膠質(zhì)細胞中可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達促進或抑制細胞的凋亡[13,14]。本研究結(jié)果顯示，缺氧可下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達，而姜黃素可緩解此效應。提示姜黃素可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達降低缺氧誘導的星形膠質(zhì)細胞凋亡。

JAK2/STAT3信號通路是由多種細胞因子激活的一種信號轉(zhuǎn)導通路，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[15-17]。有研究顯示，在難治性癲癇患者腦組織中神經(jīng)膠質(zhì)細胞JAK2/STAT3信號通路p-JAK2和p-STAT3表達明顯高于對照組[18]。姜黃素可通過下調(diào)JAK2/STAT3信號通路降低小膠質(zhì)細胞的活力[19]，姜黃素是否可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路影響星型膠質(zhì)細胞活力及凋亡還未可知，本研究檢測到姜黃素可降低缺氧引起的星型膠質(zhì)細胞中p-JAK2和p-STAT3表達的升高，通過加入JAK2/STAT3信號通路抑制劑AG490，將細胞分為缺氧+姜黃素組和缺氧+姜黃素+AG490組，檢測姜黃素是否通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路而對細胞產(chǎn)生影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧+姜黃素+AG490組細胞活力和凋亡率均明顯低于缺氧+姜黃素組。這提示姜黃素還可以通過JAK2/STAT3信號通路調(diào)節(jié)細胞活力。

綜上所述，姜黃素可降低缺氧下大鼠星型膠質(zhì)細胞活力，降低細胞凋亡，其調(diào)節(jié)機制與JAK2/STAT3信號通路有關。本研究提示姜黃素可通過影響星型膠質(zhì)細胞活力和細胞凋亡而對腦損傷起保護作用，可能成為腦損傷治療的有效藥物。