陳 燊, 洪 涌, 何小三, 韓永明, 彭 軍, 朱靜靜, 肖清鐵,2, 鄭新宇,2, 林瑞余,2

(1.福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實驗室/福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350002)

重金屬污染土壤嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育和農(nóng)產(chǎn)品安全，研究重金屬的植物有效性、毒性及其代謝，將有助于揭示植物的重金屬抗性機(jī)制.許多研究表明，有機(jī)酸在植物抗重金屬毒害等逆境脅迫中起重要作用[1-3].有機(jī)酸是含有一個或多個羧基的化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)和根系環(huán)境中，易與金屬發(fā)生絡(luò)合或螯合作用.不同有機(jī)酸與金屬的絡(luò)合能力大小與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，草酸、檸檬酸和酒石酸等的2個COOH直接相連或具有成對的OH/COOH依附在2個相鄰的碳原子上，可與重金屬形成五元或六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的螯合物，結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定[4].植物根系分泌的有機(jī)酸可結(jié)合土壤中的重金屬，提高其重金屬耐性[5].植物體內(nèi)及根系分泌的有機(jī)酸可通過改變重金屬的形態(tài)，影響重金屬的行為，降低重金屬的毒性，從而促進(jìn)植物對重金屬的吸收[6,7].進(jìn)入植物體內(nèi)的重金屬可與儲存在液泡中的有機(jī)酸螯合，轉(zhuǎn)化成低毒或無毒的螯合態(tài)，從而增強(qiáng)了植物的抗性[8,9].Kupper et al[9]研究表明，在遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)成熟及衰老的葉片中，積累的鎘大部分以Cd-有機(jī)酸復(fù)合物的形式貯存在表皮細(xì)胞的液泡中.添加外源有機(jī)酸能提高蓖麻對鎘的積累[10].孫瑞蓮等認(rèn)為龍葵葉片中的有機(jī)酸與其鎘的超積累特性有關(guān)[11].可見，有機(jī)酸作為重金屬元素的配體，不僅參與了重金屬的吸收、運(yùn)輸、積累等過程，促進(jìn)了植物對重金屬的超積累，還能通過與進(jìn)入植物體內(nèi)的重金屬結(jié)合，保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)重要蛋白及酶的活性，降低了重金屬的毒害，有機(jī)酸可能是超積累植物耐重金屬毒害的重要機(jī)制[12].唇形科植物紫蘇(Perillafrutescens)是一種藥食兩用的作物，在中國具有悠久的栽培歷史[13].近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇是一種有效的鎘富集植物，但其鎘富集機(jī)制尚不明確[14,15].為此，本研究從有機(jī)酸代謝的角度，探討紫蘇的鎘耐性.

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與取樣

試驗于2017年5—7月在福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院玻璃溫室進(jìn)行.供試紫蘇為尖葉紫蘇，前研究表明具有較強(qiáng)的鎘富集能力[15].

紫蘇的培養(yǎng)采用水培法，營養(yǎng)液參照Hoagland配方[15].挑選飽滿紫蘇種子，用0.05% NaClO浸泡消毒30 min,再用蒸餾水沖洗干凈,用0.5 mg·L-1赤霉素處理2 h后,播于溫室試驗田中，待幼苗長至10 cm(4片真葉)時，選擇長勢一致的幼苗，將其移至40 cm×30 cm×15 cm的塑料盆中，植株以塑料泡沫板和海綿固定, 每盆培養(yǎng)32株，并加入10 L完全營養(yǎng)液,營養(yǎng)液pH約5.5.紫蘇水培7 d后，進(jìn)行添加CdCl2溶液處理，鎘處理濃度設(shè)0、2、5和10 mg·kg-14個水平，3 次重復(fù)，每周更換1次營養(yǎng)液，在處理的0、7、14和21 d分別取樣，分析紫蘇有機(jī)酸和鎘含量，并測定其生物量.

各處理隨機(jī)選擇長勢一致的植株6株，用去離子水淋洗根部3次，濾紙吸干表水后，按照根、莖和葉分別取樣6份，每份樣品鮮重0.2 g，用錫箔紙包好后，迅速置于液氮中冷凍，隨后保存至-80 ℃冰箱中備用，各處理3次重復(fù)，該樣品用于有機(jī)酸分析.在采集有機(jī)酸分析樣品時，用同樣的方法取樣測定各處理紫蘇根、莖和葉的鮮重，樣品經(jīng)烘干后，用于鎘含量分析并計算紫蘇生物量.

1.2 有機(jī)酸含量測定

有機(jī)酸含量測定采用HPLC法進(jìn)行[16].取出各處理保存在-80 ℃冰箱紫蘇根、莖、葉樣品，立即加液氮研磨后，稱取粉末0.1 g，加入10 mL 0.1%磷酸二氫鉀溶液溶，浸泡4 h，超聲萃取30 min，過濾，濾液3 500 r·min-1離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶內(nèi)，4 ℃保存，用于有機(jī)酸分析.HPLC儀器型號為安捷倫1260，檢測條件：色譜柱C18，等度洗脫，流動相為甲醇(5%)和0.1%磷酸二氫鉀溶液(95%)，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃.草酸、酒石酸、丙酮酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸標(biāo)樣為分析純，采用外標(biāo)法進(jìn)行有機(jī)酸定量.

1.3 鎘含量測定

鎘含量測定采用原子吸收分光光度計法[17].測定鮮重后的紫蘇根、莖、葉樣品，經(jīng)105 ℃殺青1 h后，72 ℃烘干，經(jīng)粉碎、過60目篩后，備用.準(zhǔn)確稱取紫蘇粉末0.5 g，加入混酸(HNO3∶HClO4=4∶1)15 mL，消化后用于鎘含量測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

紫蘇地上部及全株的鎘含量是各處理根、莖、葉的加權(quán)平均值.數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行，結(jié)果以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示；統(tǒng)計分析、相關(guān)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，不同處理間的差異顯著性采用LSD法比較、Pearson雙側(cè)檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子量有機(jī)酸定量分析方法

在設(shè)定分析條件下，有機(jī)酸混合標(biāo)樣的HPLC圖譜如圖1所示.在12 min內(nèi)9種低分子量各有機(jī)酸得到完全分離，重復(fù)性好，可用于定量檢測.通過外標(biāo)法建立的定量分析回歸方程如下：

草酸：y=24.255 0x+4.360 1，r=0.999 7； 酒石酸：y=2.446 1x+0.861 2，r=0.999 5；丙酮酸：y=47.046 0x-5.417 4，r=0.999 3；抗壞血酸：y=12.455 0x-0.799 7，r=0.999 7；乙酸：y=2.614 7x+0.117 9，r=0.999 8；檸檬酸：y=1.655 8x-0.247 1，r=0.999 3；富馬酸：y=190.790 0x-0.224 8，r=0.999 8；琥珀酸：y=0.805 9x+0.184 8，r=0.999 3；丙酸：y=0.823 7x+0.170 0，r=0.999 6.

1.草酸;2.酒石酸;3.丙酮酸;4.抗壞血酸;5.乙酸;6.檸檬酸;7.富馬酸;8.琥珀酸;9.丙酸.圖1 混合標(biāo)樣溶液色譜圖Fig.1 Mixed standard sample solution chromatogram

2.2 鎘脅迫下紫蘇各器官有機(jī)酸平均含量

結(jié)果表明，紫蘇體內(nèi)共檢測到8種低分子量有機(jī)酸，包括草酸、酒石酸、丙酮酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸(表1).不同處理條件下，紫蘇有機(jī)酸總含量大小為：莖>葉>根.根部有機(jī)酸總濃度平均值為8 676.6 μg·g-1，其中草酸占75.74%，酒石酸1.72%，琥珀酸16.96%，檸檬酸3.25%，乙酸2.04%，抗壞血酸0.14%，丙酮酸0.10%，富馬酸0.05%；莖部有機(jī)酸總濃度平均值為13 530.2 μg·g-1，草酸占64.46%，酒石酸2.67%，檸檬酸17.88%，琥珀酸12.17%，乙酸2.54%，抗壞血酸0.14%，丙酮酸0.10%，富馬酸0.03%；葉片有機(jī)酸總濃度平均值為9 963.7 μg·g-1，草酸占69.72%，酒石酸1.57%，琥珀酸20.34%，檸檬酸4.88%，乙酸2.91%，抗壞血酸0.37%，丙酮酸0.17%，富馬酸0.05%.可見，紫蘇根莖葉中乙酸、抗壞血酸、丙酮酸和富馬酸含量相對較低，草酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸含量占測定有機(jī)酸總量的95%以上，是主要的低分子量有機(jī)酸，在后續(xù)研究中主要討論草酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸含量的動態(tài).

表1 鎘脅迫下紫蘇不同器官的有機(jī)酸平均含量1)Table 1 The average content of organic acids in different organs of P. frutescens under cadmium stress (μg·g-1)

1)同一欄中不同小寫字母表示不同器官間差異顯著(P<0.05).

2.3 紫蘇根部有機(jī)酸含量動態(tài)

由圖2可見，隨著處理時間的增加，有機(jī)酸含量總體呈上升趨勢.從總酸含量看，在0、7、14、21 d無鎘處理的總酸含量無顯著差異，與2 mg·L-1鎘處理間亦無顯著差異，經(jīng)5、10 mg·L-1鎘處理后，總酸含量顯著上升，且10 mg·L-1鎘處理的高于5 mg·L-1鎘處理.酒石酸、檸檬酸、草酸動態(tài)與總酸類似，其含量隨處理時間和鎘濃度的增加而升高，在處理14、21 d時，不同鎘處理的有機(jī)酸含量均顯著高于0 mg·L-1鎘處理；乙酸含量總體呈先升后降趨勢；0、2、5 mg·L-1鎘處理的琥珀酸隨時間增加而下降，10 mg·L-1鎘處理的琥珀酸含量隨培養(yǎng)時間增加呈先升后降趨勢.

2.4 紫蘇莖部有機(jī)酸含量動態(tài)

由圖3可見，與根部相似，鎘處理前(0 d)紫蘇莖部各有機(jī)酸含量均無顯著差異；隨著處理時間的增加，有機(jī)酸含量上升.在14、21 d時，5、10 mg·L-1鎘處理的總酸含量顯著高于其余各處理的(圖3).酒石酸、草酸含量隨處理時間、鎘濃度的增加而增大，0、2 mg·L-1鎘處理的檸檬酸含量隨時間增加顯著下降，5、10 mg·L-1鎘處理的檸檬酸含量隨時間增加先降后升，5、10 mg·L-1鎘處理14 d的乙酸含量顯著高于其余各處理.在處理7、14和21 d時，10 mg·L-1鎘處理的琥珀酸含量顯著高于其余處理，且其余處理間無顯著差異(圖3).

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).圖2 紫蘇根部有機(jī)酸含量隨處理時間變化Fig.2 Changes of organic acid content in P. frutescens root with treatment time

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).圖3 紫蘇莖部有機(jī)酸含量隨處理時間變化Fig.3 Changes of organic acid content in stems of P. frutescens with treating time

2.5 紫蘇葉片有機(jī)酸含量動態(tài)

由圖4可見，與根和莖部相似，鎘處理前(0 d)紫蘇葉部各有機(jī)酸的含量無顯著差異，經(jīng)過21 d處理后，不同鎘處理的有機(jī)酸總量顯著下降.檸檬酸含量隨處理時間的增加顯著下降；酒石酸、草酸、琥珀酸含量隨處理時間增加呈先升后降的趨勢，乙酸含量隨處理時間和濃度的增加而增大(圖4).

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).圖4 紫蘇葉部有機(jī)酸含量隨處理時間變化Fig.4 Changes of organic acid content in leaves of P. frutescens with treating time

2.6 紫蘇鎘含量及與有機(jī)酸含量的相關(guān)性

結(jié)果表明，不同處理濃度紫蘇根、莖、葉鎘含量均隨著處理時間增加顯著增大.在相同處理時間下，不同濃度鎘處理紫蘇的鎘含量間亦存在顯著差異(圖5).從不同鎘處理濃度和時間下的平均值看，紫蘇鎘含量在不同器官間存在顯著差異，高低表現(xiàn)為：根(753.1 μg·g-1)>莖(135.6 μg·g-1)>葉(96.9 μg·g-1).

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，nd表示未檢出.圖5 紫蘇根、莖和葉部鎘含量隨處理時間變化Fig.5 Changes of cadmium content in roots, stems and leaves of P. frutescens with treating time

相關(guān)分析表明，紫蘇不同器官的鎘含量與有機(jī)酸含量的相關(guān)性存在顯著差異(表2).紫蘇根、莖的鎘含量與有機(jī)酸總量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，而葉片的鎘含量與有機(jī)酸總量呈顯著的負(fù)相關(guān).紫蘇根的鎘含量與草酸、酒石酸含量顯著正相關(guān)，與富馬酸顯著負(fù)相關(guān)；莖的鎘含量與酒石酸、丙酮酸、抗壞血酸、檸檬酸及琥珀酸含量顯著正相關(guān)；葉的鎘含量與草酸及檸檬酸含量顯著負(fù)相關(guān)，而與抗壞血酸、乙酸含量顯著正相關(guān)(表2).

表2 紫蘇根、莖、葉鎘含量與有機(jī)酸含量的相關(guān)性1)Table 2 Correlation between cadmium content and organic acid content in roots, stems and leaves of P.frutescens

1)*表示在0.05水平上顯著相關(guān);**表示在0.01水平上顯著相關(guān).

3 結(jié)論與討論

一些研究表明，有機(jī)酸、氨基酸、金屬硫蛋白(MTs)和植物螯合肽(PCs)等植物抗金屬毒害中起到重要作用[1-8].分析植物體內(nèi)有機(jī)酸種類與含量有助闡明其金屬抗性機(jī)制[4].孫瑞蓮等在鎘超積累植物龍葵不同生育期的葉片中均檢測到乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸，其含量隨龍葵的生育期而變化，認(rèn)為有機(jī)酸能夠指示鎘積累的變化[11].紫蘇也是一種鎘富集植物，具有較強(qiáng)的鎘耐性[15].不同鎘處理濃度與處理時間的紫蘇的根、莖、葉中均檢測到草酸、酒石酸、丙酮酸、抗壞血酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸，有機(jī)酸總量在各器官間的高低順序為：莖>根>葉(表1)，結(jié)果表明，紫蘇不同器官的有機(jī)酸積累能力存在差異.在各器官中，含量較高的3種有機(jī)酸均為草酸、檸檬酸和琥珀酸，但其含量高低在根、莖、葉中的表現(xiàn)也不完全一致，根部：草酸>琥珀酸>檸檬酸，莖部：草酸>檸檬酸>琥珀酸，葉片：草酸>琥珀酸>檸檬酸.草酸的含量最高，這與麻瑩等研究發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫下堿地膚葉片積累的7種有機(jī)酸以草酸含量最高相似[18].前人研究表明，草酸在植物體內(nèi)具有重要的生物學(xué)功能.它參與細(xì)胞體內(nèi)Ca2+、pH和滲透壓等的調(diào)節(jié)，植物病原菌防御反應(yīng)與金屬解毒等過程[19].草酸對鎘等金屬離子具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，在紫蘇根莖葉的有機(jī)酸中，草酸所占的比例高達(dá)65%～75%，這對提高紫蘇的鎘耐性具有重要意義.

從有機(jī)酸含量隨時間的變化看，雖然鎘脅迫下紫蘇所含的有機(jī)酸種類未發(fā)生變化，但有機(jī)酸總量隨著鎘處理濃度和時間的增加顯著增大，鎘脅迫促進(jìn)了紫蘇有機(jī)酸的生物合成與積累，這與前人研究結(jié)論相一致[20-21].Cd脅迫下礦山型東南景天釋放出更多的有機(jī)酸(如草酸和酒石酸等)，通過草酸和酒石酸等對鎘的絡(luò)合作用，降低了植物體內(nèi)游離態(tài)的鎘離子濃度，從而降低了鎘的毒害[22].砷脅迫下黑藻的草酸分泌量顯著升高，添加外源草酸也能促進(jìn)其對砷的吸收[23]，同理，添加外源檸檬酸和酒石酸能夠降低鉛、鋅對番茄幼苗的毒害[24].較高濃度的鎘脅迫雖然抑制了紫蘇的生長，且抑制效應(yīng)亦隨處理濃度的增加而增大[14]；但紫蘇的鎘含量亦隨著處理濃度和時間的增加而升高，其地上部及全株的鎘平均含量均大于100 mg·kg-1，顯示出紫蘇較強(qiáng)的鎘富集能力(圖5).同時紫蘇體內(nèi)的草酸、檸檬酸和琥珀酸含量亦隨著鎘處理濃度和時間的增加而升高，這表明紫蘇體內(nèi)的草酸，檸檬酸和琥珀酸含量顯著升高，有效地減輕了鎘毒害，提高了鎘耐性并促進(jìn)了鎘積累.此外，紫蘇根部的鎘含量與草酸、酒石酸含量顯著正相關(guān)，莖部鎘含量與檸檬酸、琥珀酸含量顯著正相關(guān)，而紫蘇葉片的鎘含量與草酸含量負(fù)相關(guān)，說明紫蘇體內(nèi)草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸的積累增強(qiáng)有助于根、莖中鎘的富集，這與一些解毒機(jī)制的研究認(rèn)為，植物體外的有機(jī)酸可通過與根際游離的金屬離子螯合形成穩(wěn)定合物復(fù)合體，改變其有效性，降低金屬的移動性，從而實現(xiàn)解毒的結(jié)論不一致[5,25].一般地，土壤環(huán)境中的重金屬可被植物根系分泌的草酸等有機(jī)酸結(jié)合活化，使其更易遷至根表，其生物毒性亦隨之大大降低.但結(jié)合活化的重金屬究竟是進(jìn)一步進(jìn)入根系，抑或繼續(xù)存留于根際環(huán)境，可能涉及到植物的生物學(xué)特性及其復(fù)雜轉(zhuǎn)運(yùn)過程[8].但紫蘇體內(nèi)積累的草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等是否通過根系分泌作用活化了環(huán)境中的鎘，并促進(jìn)其從根部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖部，有待進(jìn)一步研究證實[26].另外，葉片是草酸的主要合成場所，合成途徑包括乙醛酸/乙醇酸途徑、抗壞血酸途徑和草酰乙酸合成途徑，但合成的草酸是否向下運(yùn)輸以及運(yùn)輸過程是否對葉片的鎘具有淋洗作用，有待深入研究.