張生彬，陳冰，董子龍，劉瑞，云哲琳

（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

胰腺癌（pancreatic carcinoma）是目前已知惡性程度較高、預(yù)后較差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其早期診斷困難，多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已處于中晚期[1-5]。隨著外科技術(shù)的進(jìn)步，胰腺癌的手術(shù)切除率有較大提高，圍手術(shù)期病死率及合并癥發(fā)生率也出現(xiàn)顯著下降，但手術(shù)治療的效果仍無顯著改善，其5年生存率仍低于20%[6-9]。因此，研究新型的腫瘤標(biāo)記物用于臨床上早發(fā)現(xiàn)以及分子靶向治療具有重大意義。人磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4（human phosphatidylethanolamine-binding protein 4，hPEBP-4）是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族的一個(gè)新成員，是一種新的抗凋亡分子，已有研究[10-14]證實(shí)其在肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，是一種腫瘤的致病因子。但目前國內(nèi)外尚未有關(guān)于hPEBP-4在胰腺癌中的表達(dá)的報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，qRT-PCR）、免疫組織化學(xué)和Western blot方法檢測胰腺癌及其癌旁組織中hPEBP-4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討hPEBP-4與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為胰腺癌的預(yù)后判斷以及靶向治療等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集內(nèi)蒙古包剛醫(yī)院病理科2012年4月—2013年10月經(jīng)臨床和病理診斷為胰腺癌的患者30例，所有患者經(jīng)手術(shù)切除病灶，收集手術(shù)切除的胰腺癌組織及其癌旁組織各30例，實(shí)驗(yàn)所選取的癌旁組織與胰腺癌癌灶的距離均＞2 cm。所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療，且均具有完整的臨床資料。本實(shí)驗(yàn)所有標(biāo)本的獲取均事先征得患者及其家屬的同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 qRT-PCR檢測

將保存于-80 ℃的胰腺癌組織及其癌旁組織各取100 mg左右，按照TRIzol法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增以檢測胰腺癌組織及其癌旁組織中hPEBP-4 mRNA的表達(dá)。hPEBP-4-F：5'-GGG TTG GAC AAT GAG GCT G-3'，hPEBP-4-R：5'-TGT GCT TGG GCT CGC TGG C-3'；β-actin-F：5'-GAT CAT TGC TCC TCC TGA-3'，β-actin-R：5'-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3'。其擴(kuò)增體系為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。采用2-△△CT進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 Western blot

將保存于-80 ℃的胰腺癌組織及其癌旁組織各取100 mg左右提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔加入20 μL蛋白樣品，12%的SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（PVDF）上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入山羊抗人多克隆hPEBP-4一抗（Abcam，a b 9 9 4 6 8，稀釋比1:5 0 0）后4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后，加入特異性驢抗山羊二抗（Abcam，ab205723，稀釋比1:2 000），室溫孵育1 h后洗膜，顯影拍照。

1.4 免疫組化

胰腺癌組織及其癌旁組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測hPEBP-4蛋白的表達(dá)，其具體步驟如下：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，置于3%過氧化氫溶液中進(jìn)行室溫孵育15 min以去除內(nèi)源性過氧化酶，pH=6.0的檸檬酸溶液中煮沸后冷卻至室溫，用PBS溶液浸洗3次。血清室溫封閉30 min后滴加hPEBP-4（1:50）一抗，37 ℃溫箱孵育1 h，加二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下觀察至顯色合適為止，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)后梯度酒精脫水，二甲苯透明，固定封片后拍照觀察。

1.5 免疫組化結(jié)果判定

hPEBP-4定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，其陽性染色呈棕黃色。每個(gè)切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：⑴ 按細(xì)胞染色強(qiáng)度記分：無染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。⑵ 按陽性細(xì)胞所占百分比記分：陽性細(xì)胞數(shù)≤1%記為0分，1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～100%記為3分。最后將兩項(xiàng)得分相乘的分值為標(biāo)準(zhǔn)：總分0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床病理參數(shù)與hPEBP-4表達(dá)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用Log-rank檢驗(yàn)比較不同的生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌組織及其癌旁組織中hPEBP-4 mRNA的表達(dá)

采用qRT-PCR對30對胰腺癌組織及其癌旁組織中hPEBP-4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，其結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，胰腺癌組織中hPEBP-4 mRNA表達(dá)上調(diào)者24例（24/30，80.0%），下調(diào)者6例（6/30，20.0%）（圖1）。

2.2 胰腺癌組織及其癌旁組織中hPEBP-4蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證hPEBP-4在胰腺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況，采用Western blot和免疫組化檢測其蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果與qRTPCR結(jié)果一致，即與癌旁組織比較，胰腺癌組織中hPEBP-4 mRNA表達(dá)上調(diào)者24例（24/30，80.0%），下調(diào)者6例（6/30，20.0%）；免疫組化結(jié)果顯示，胰腺癌組織中hPEBP-4 mRNA表達(dá)者24例（24/30，80.0%），低表達(dá)者6例（6/30，20.0%），而癌旁組織hPEBP-4 mRNA高表達(dá)5例（5/30，16.7%），低表達(dá)者25例（25/30，83.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.093，P＜0.001）（圖2）。

圖1 qRT-PCR檢測30對胰腺癌組織及其癌旁組織中hPEBP-4 mRNA的表達(dá)Figure 1 The mRNA expressions of hPEBP-4 in the 30 paired pancreatic cancer tissue and adjacent tissue detected by qRT-PCR

圖2 hPEBP-4蛋白表達(dá)水平的檢測 A：其中8例樣本W(wǎng)estern blot檢測結(jié)果；B：其中2例樣本的免疫組化檢測結(jié)果（×400）Figure 2 Measurement of hPEBP-4 protein expression A:Western blot results from 8 cases; B: Immunohistochemical staining results from 2 cases (×400)

2.3 hPEBP-4與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析hPEBP-4的表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，hPEBP-4的表達(dá)水平與胰腺癌患者的腫瘤分化程度以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05），但是與患者的性別、年齡、血管浸潤、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)浸潤無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。對血清CA19-9和CEA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以CA19-9＞37 U/mL，CEA＞5 ng/mL為異常高表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)。CA19-9異常高表達(dá)與hPEBP-4的表達(dá)水平有關(guān)（P＜0.05），但CEA異常高表達(dá)與hPEBP-4的表達(dá)水平無關(guān)（P＞0.05）。

表1 hPEBP-4表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 1 The relationship between hPEBP-4 expression and clinicopathological variables of pancreatic cancer patients[n (%)]

2.4 hPEBP-4與分化程度、TNM分期、血清CA19-9的關(guān)系

胰腺癌分化程度與hPEBP-4呈負(fù)相關(guān)，隨著hPEBP-4表達(dá)升高，胰腺癌分化程度越低；TNM分期與hPEBP-4呈負(fù)相關(guān)，隨著hPEBP-4表達(dá)升高，TNM分期越低；血清CA19-9水平與hPEBP-4呈正相關(guān)，隨著hPEBP-4表達(dá)升高，血清CA19-9水平異常升高。相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2 hPEBP-4與分化程度、TNM分期、血清CA19-9的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of hPEBP-4 with the differentiation degree,TNM stage and serum ca19-9 level

2.5 hPEBP-4與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

對30例患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，隨訪時(shí)間為15～60個(gè)月，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，其結(jié)果顯示，hPEBP-4低表達(dá)患者的總生存率明顯高于hPEBP-4高表達(dá)患者，使用Log-rank進(jìn)行組間生存率檢驗(yàn)，其結(jié)果顯示，hPEBP-4高表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)（χ2=8.658，P=0.003）（圖3）。

圖3 不同hPEBP-4表達(dá)水平胰腺癌患者的生存曲線Figure 3 The survival curves of pancreatic cancer patients with different hPEBP-4 expression levels

3 討 論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其惡性程度高，存活率極低，預(yù)后極差，近些年的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，由于其早期診斷較困難，大多數(shù)患者被確診時(shí)病情已發(fā)展至中晚期[15-19]。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與多種腫瘤相關(guān)基因的過度表達(dá)以及腫瘤抑制基因的失活具有密切關(guān)系[20-22]。因此，尋求新型的腫瘤標(biāo)記物用于胰腺癌患者的早期診斷、分子靶向治療以及明確胰腺癌患者的預(yù)后具有重大意義。

hPEBP-4是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族的一個(gè)新成員，是一種新型的抗凋亡蛋白，已有研究[10-12]證實(shí)其在肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，是一種腫瘤的致病因子。虞桂平等[23]（2012）的研究發(fā)現(xiàn)hPEBP-4陽性表達(dá)在肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，其在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織，且hPEBP-4表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌的分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05）。林發(fā)澄[24]發(fā)現(xiàn)hPEBP-4在前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率（8 4.8 9%）顯著高于其在前列腺增生組織中的陽性表達(dá)率（17.50%），且hPEBP-4的陽性表達(dá)與前列腺癌患者的分化程度、臨床分期以及Gleason評分具有顯著相關(guān)性，即表明hPEBP-4的表達(dá)可能影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，并在一定程度上可幫助前列腺癌的診斷。臨床上總結(jié)出hPEBP-4與多種腫瘤的分化、TNM分期以及轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此可以推測hPEBP-4與胰腺癌的分化、TNM分期以及轉(zhuǎn)移相關(guān)，但需要臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證此推測。而分子方面，研究[25-26]發(fā)現(xiàn)hPEBP-4還參與JNK信號通路的抑制，可促進(jìn)Akt的激活，從而參與抑制細(xì)胞凋亡的過程。這可能是hPEBP-4參與腫瘤分化，TNM分期以及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制之一。本研究通過qRT-PCR法分別檢測30例胰腺癌組織及其配對癌旁組織中hPEBP-4 mRNA水平，與癌旁組織相比，胰腺癌組織中hPEBP-4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（24/30，80%），提示hPEBP-4可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。隨后采用Western blot與免疫組化檢測hPEBP-4蛋白的表達(dá)，結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致。在基因和蛋白水平上，hPEBP-4的表達(dá)量與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展均有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，hPEBP-4的表達(dá)水平與胰腺癌患者的腫瘤分化程度、CA19-9以及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），但是與患者的性別、年齡、血管浸潤、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA以及神經(jīng)浸潤無關(guān)（均P＞0.05），且胰腺癌分化程度、TNM分期均與hPEBP-4呈負(fù)相關(guān)，而血清CA19-9水平與hPEBP-4呈正相關(guān)。hPEBP-4低表達(dá)患者的總生存率明顯高于hPEBP-4高表達(dá)患者（P＜0.05），這一結(jié)果提示hPEBP-4高表達(dá)可能是導(dǎo)致胰腺癌患者預(yù)后較差的一個(gè)重要原因。

綜上所述，本研究顯示hPEBP-4在胰腺癌中處于高表達(dá)狀態(tài)，且與胰腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)，其參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證，然而hPEBP-4在胰腺癌中的高表達(dá)為胰腺癌的前期診斷、靶向治療以及預(yù)后提供了新的思路。