陶 劍，馮磊磊，張德隆，孟 立，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，張守全

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

近年來(lái)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)高速發(fā)展，養(yǎng)殖的主要方式已經(jīng)從傳統(tǒng)粗放型的散養(yǎng)模式向集約化、規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化、專業(yè)化方向轉(zhuǎn)變。而規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)常年不斷發(fā)生細(xì)菌病，細(xì)菌的混合感染或者繼發(fā)性感染是導(dǎo)致豬群的發(fā)病率和死亡率增高的重要原因[1]。細(xì)菌病的傳播多為通過(guò)空氣傳播，殺滅空氣和欄舍表面的細(xì)菌可有效防治豬病。中藥熏香是操作簡(jiǎn)單、消毒效果好并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的有效途徑之一。在我國(guó)，中藥熏香療法具有悠久的歷史并被廣泛的應(yīng)用于臨床，防治多種疾病[2]。熏香經(jīng)燃燒后產(chǎn)生微粒性煙塵，經(jīng)呼吸道或者皮膚吸入等方式進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效，達(dá)到消毒殺菌、增強(qiáng)身體免疫力、促進(jìn)體內(nèi)調(diào)和能力、驅(qū)蟲滅蚊等作用[3-4]。有研究表明，中草藥熏香劑可以調(diào)節(jié)大鼠免疫器官、全血T細(xì)胞亞群及肺泡灌洗液中 IFN（干擾素）-γ 水平[5]，提高血清 sIgA、IL（白細(xì)胞介素）-6水平[6]，增強(qiáng)免疫力。本試驗(yàn)研究了中草藥熏香燃煙及其溶解物抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌的活性，為利用中草藥熏香防控豬病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年6—8月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 材料

中草藥熏香由廣東天地本草飼料科技股份有限公司提供，其主要成分包括艾草、蒼術(shù)、五倍子、芡實(shí)、玉竹等10數(shù)種中草藥。標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌。M-H培養(yǎng)基購(gòu)置于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，定性濾紙購(gòu)置于杭州沃華濾紙有限公司，100 mm培養(yǎng)皿、0.45 μm、0.22 μm 過(guò)濾器等均購(gòu)置于廣州佳妍生物有限公司。

1.3 中草藥熏香燃煙提取物

準(zhǔn)確稱量熏香，以3倍的超純水或75%乙醇溶解燃煙。以1 g熏香完全燃盡通過(guò)溶解裝置并溶解于1 mL相應(yīng)的溶劑作為熏香1 g/mL的生藥濃度。點(diǎn)燃熏香，放入大錐形瓶中，泵入空氣通過(guò)集氣瓶洗氣裝置溶解煙霧，合并3個(gè)集氣瓶的溶液，60℃烘箱濃縮成熏香生藥濃度10 g/mL的溶液。分別用超純水和75%乙醇吸收濃縮得到水溶解物和乙醇溶解物，水溶解物烘干后用二甲基亞砜（DMSO）溶解得到DMSO溶解物，乙醇溶解物干燥除去乙醇后用DMSO重溶解得到乙醇-DMSO溶解物；0.22 μm過(guò)濾除菌后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥敏試紙

用6 mm打孔器將定性濾紙打成6 mm圓形紙片，高溫高壓滅菌，烘干。在超凈臺(tái)中用移液槍吸取2.5 μL的提取液滴加到無(wú)菌濾紙片上，自然風(fēng)干，重復(fù)10次得到藥敏試紙，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌液制備

在超凈工作臺(tái)中將金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌接種到LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆接種到無(wú)菌LB培養(yǎng)基中200 r/min、37℃搖菌6～8 h，然后用LB培養(yǎng)基配置成0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛龋ㄏ喈?dāng)于1.5×108cfu/mL細(xì)菌濃度），再稀釋成1.0×106cfu/mL的菌液作初篩和測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑

在超凈工作臺(tái)上將高溫高壓滅菌后的M-H瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿15～20 mL。待冷卻凝固后，吸取200 μL稀釋10倍的菌液（相當(dāng)于1.5×107cfu/mL）滴加到平皿上并均勻涂布。再用無(wú)菌鑷子夾取各藥敏試紙放到含菌培養(yǎng)基表面、37℃培養(yǎng)48 h，每組重復(fù)3次。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，重復(fù)測(cè)量3次。

1.7 最小抑菌濃度MIC的確定

取無(wú)菌96孔板，每排加入100 μL培養(yǎng)基，然后在第2孔加入100 μL提取液，充分混勻后取出100 μL移至第3孔中，以此類推倍比稀釋至第11孔，混勻后棄掉100 μL。每排第1孔至加培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，第2孔起加入100 μL菌液（濃度1.0×106cfu/mL），第12孔不加提取液作為陽(yáng)性對(duì)照，37℃培養(yǎng)18 h后觀察，以培養(yǎng)基清澈的最低濃度為抑菌濃度。

1.8 菌落計(jì)數(shù)法模擬現(xiàn)場(chǎng)殺菌作用

在超凈工作臺(tái)中用LB培養(yǎng)基將0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛鹊木海ㄏ喈?dāng)于1.5×108cfu/mL細(xì)菌濃度）稀釋105倍，吸取100 μL菌液均勻涂布在100 mm無(wú)菌M-H瓊脂培養(yǎng)基上。在超凈工作臺(tái)中點(diǎn)燃中草藥熏香，待產(chǎn)生均勻穩(wěn)定的煙霧后，將涂布好的平板開蓋倒扣在煙霧上方約30 cm處，分別停留0 min、1 min、5 min、10 min、30 min、60 min，結(jié)束后 37 ℃培養(yǎng) 12 h，每組重復(fù)3次，觀察記錄不同時(shí)間的菌斑數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS Statistics 19.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熏香燃煙水溶解物和不同溶解物的抑菌圈結(jié)果

熏香燃煙不同溶解物對(duì)5種菌的抑菌大小如表1所示。其中，乙醇-DMSO溶解物對(duì)5種菌的抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑分別為（11.95±0.40）mm、（7.19±0.08）mm、（7.13±0.13）mm、（8.78±0.26）mm、（12.54±0.19）mm；而水-DMSO溶解物對(duì)大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的效果次之，水溶解物抑菌圈直徑最小。而對(duì)于沙門氏菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌，水溶解物的抑菌圈直徑則大于水-DMSO溶解物。

表1 熏香燃煙不同溶解物對(duì)5種細(xì)菌抑菌圈直徑的初篩結(jié)果 mm

2.2 熏香燃煙水溶解物和不同溶解物對(duì)細(xì)菌的MIC

采用微量稀釋法分別測(cè)定熏香不同溶解物對(duì)5種細(xì)菌的MIC，結(jié)果如表2所示。乙醇-DMSO溶解物對(duì)5種細(xì)菌最為敏感，抑菌濃度最低，其次為水-DMSO溶解物，最次水溶解物。各溶解物對(duì)金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，尤以乙醇-DMSO溶解物的MIC最小，分別為39.1 mg/mL和78.1 mg/mL。

表2 熏香燃煙不同溶解物對(duì)5種細(xì)菌的MIC mg/mL

2.3 熏香對(duì)不同細(xì)菌模擬現(xiàn)場(chǎng)殺菌作用

熏香經(jīng)模擬現(xiàn)場(chǎng)殺菌試驗(yàn)測(cè)試，結(jié)果如表3、表4所示，經(jīng)過(guò)10～30 min的煙熏，可以完全殺滅涂布在平板上的5種細(xì)菌。其中以對(duì)嗜水氣單胞菌的效果最好，煙熏1 min的滅菌率為（29±1）%，煙熏5 min之后已能全部殺滅；其次為鏈球菌和大腸桿菌，煙熏10 min后平板上分別還有（6.33±4.10）cfu和（7.33±0.33）cfu，滅菌率分別為（94±4）%和（97±0）%。而對(duì)金黃色葡萄糖球菌和沙門氏菌則需要更長(zhǎng)時(shí)間的煙熏才能達(dá)到殺菌作用。

表3 熏香對(duì)不同細(xì)菌模擬現(xiàn)場(chǎng)殺菌作用

表4 熏香對(duì)不同細(xì)菌模擬現(xiàn)場(chǎng)的殺菌率

3 討論

現(xiàn)代養(yǎng)殖場(chǎng)是疾病的重災(zāi)區(qū)和細(xì)菌污染源，疾病的防治是養(yǎng)殖場(chǎng)的重要環(huán)節(jié)。殺滅空氣中病菌是防治疾病的有效手段之一。豬場(chǎng)內(nèi)常用的殺菌方式有化學(xué)消毒劑殺菌和物理方式殺菌，然而常規(guī)的化學(xué)消毒劑消毒均存在不同的毒性[7]，對(duì)豬群和人員有一定的副作用，而物理殺菌方式主要是紫外線燈殺菌，此法易引起皮膚紅斑、刺激眼結(jié)膜[8]，并且紫外線穿透力小，存在殺菌盲區(qū)，消毒不徹底。中草藥熏香源于野生植物，具有很高的安全性[9]，燃燒產(chǎn)生煙氣可以散發(fā)到整個(gè)空間，殺菌驅(qū)蚊徹底無(wú)死角，甚至在不關(guān)閉門窗時(shí)也能達(dá)到良好的效果，所產(chǎn)生的芳香性煙霧對(duì)皮膚、黏膜以及呼吸道無(wú)刺激，同時(shí)能達(dá)到止咳平喘、預(yù)防流行性感冒、增強(qiáng)免疫力等功效[8]。

艾草中含有桉油素、β-石竹烯、α-萜品烯醇以及芳樟醇等有效活性物質(zhì)，因此具有殺滅螨蟲、驅(qū)除蚊子、蒼蠅、蟑螂、螞蟻等功效以及對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、腸炎膜桿菌、葡萄球菌、釀酒酵母菌、白色念球菌、黑曲霉菌等有很好的抗菌活性。姚勇芳等[10]研究表明，艾草的水提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有較好的抑菌效果，而對(duì)霉菌抑制效果不明顯。陳羽等[11]發(fā)現(xiàn)艾葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉均起到了顯著的殺菌作用。劉巍等[12]考察了艾葉水提液對(duì)常見(jiàn)婦科致病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)艾葉水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等5種常見(jiàn)致病菌均有明顯的抑制作用。尹璐等[13]研究表明，蒼術(shù)具有廣譜抗菌作用，對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌等4種菌均具有較好的抑制作用。張霞等[14]研究表明，五倍子對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有有效的抑菌效果，其浸出物的最小抑菌濃度分別為12.5 mg/mL和6.25 mg/mL，并且50 mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相當(dāng)于2.5 mg/mL的青霉素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，可能是其中含有鞣酸的緣故。

本試驗(yàn)研究了熏香燃煙及燃煙溶解物對(duì)5種常見(jiàn)細(xì)菌的抑制作用，結(jié)果表明該熏香燃煙對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌都有一定的抑制作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑制作用較好，可能是因?yàn)槠渲械陌莺械囊志镔|(zhì)對(duì)其有較好的抑制作用，這與盧學(xué)根的研究結(jié)果相近[10]。但抑菌圈直徑較小，最大抑菌圈直徑也僅有12.5 mm，MIC試驗(yàn)也表明需要較高的濃度才能達(dá)到抑菌作用?？赡苁且?yàn)檠阒幸志镔|(zhì)的熱穩(wěn)定性較差[15]，經(jīng)過(guò)燃燒后產(chǎn)生的燃煙中有效成分含量較低或者被水或乙醇的吸收量較少，導(dǎo)致有效成分的濃度較低的緣故。

4 結(jié)論

熏香燃煙的乙醇-DMSO溶解物的抑菌效果最好，尤其是對(duì)嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的敏感程度較高，其次為水-DMSO溶解物，最次為水提取物。而直接用熏香燃煙熏10～30 min后都可以達(dá)到很好的熏滅效果，尤其對(duì)嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、鏈球菌的熏滅效果最佳。