宋雙，姜彩鴿，王國(guó)珍，樊仲慶，張怡*

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，寧夏銀川 750002）

葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）屬卵菌門單軸霉屬，是一種專性寄生菌。無(wú)性階段產(chǎn)生孢囊梗，頂生孢子囊，內(nèi)生游動(dòng)孢子。病菌的有性生殖產(chǎn)生卵孢子，于秋末在病部細(xì)胞間隙處產(chǎn)生。

由于葡萄霜霉病菌是一種寄生真菌，到目前為止在人工培養(yǎng)基（如PDA）上無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)和保存[1]，這給在不同時(shí)間、不同地點(diǎn)下研究該病菌造成很大困擾。因此，有必要尋找到有效的保存菌源的方法。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)專性寄生菌體外保存的報(bào)道很多。如Gill等[2]報(bào)道，蠶豆霜霉病菌的分生孢子用保護(hù)劑進(jìn)行處理后在-80 ℃中可保存一年，回接感病品種的葉片后，發(fā)病面積比例超過(guò)50%；Gulya等[3]報(bào)道，經(jīng)過(guò)快速冷凍干燥后向日葵和其他霜霉病菌的游動(dòng)孢子囊可以在液氮中儲(chǔ)存4年，這種冷凍干燥技術(shù)在瓜類霜霉病的致病菌孢子囊的保存中也獲得成功，但對(duì)于玉米霜霉病菌的保存不可行[4]；Bromfield等[5]的研究表明，使用二甲基亞砜（DMSO）作為煙草霜霉病菌的冷凍保護(hù)劑，分生孢子在-180 ℃液氮中儲(chǔ)存25個(gè)月后仍保留其活性和感染性；郝永娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通常黃瓜霜霉病菌的孢子囊在-30 ℃條件下保存40 d以內(nèi)感染成功，并在50 d后喪失其侵染力；張艷菊等[7]認(rèn)為，黃瓜霜霉病菌的適宜儲(chǔ)存條件為10% DMSO加5%脫脂奶在-20 ℃預(yù)處理24 h，以這種方式儲(chǔ)存的孢子囊再在-70 ℃條件下保存，即使在12個(gè)月后仍然表現(xiàn)出較高的致病性；杜興蘭等[8]研究表明，使用5% DMSO作為保護(hù)劑保存葡萄霜霉菌的孢子囊，在-76 ℃條件下儲(chǔ)存240 d后，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。

真菌活體保存的目的是提高菌株的生存力和穩(wěn)定性，但難以保存不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的寄生菌。因此，通過(guò)研究不同保護(hù)劑和保存條件，探索了葡萄霜霉病菌的較長(zhǎng)期的保存方法，解決了葡萄霜霉菌保存時(shí)間短并且致病性降低的問(wèn)題，為研究該病原菌的生物學(xué)特性、病因和預(yù)防措施奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

在金山試驗(yàn)區(qū)葡萄種植基地‘赤霞珠’品種上，于病害發(fā)生期采集霜霉病菌樣品。樣品均為生長(zhǎng)一致的單斑病葉，每片葉用報(bào)紙分隔開，裝入放有冰袋的泡沫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室。將采回的新鮮病葉先在流水下沖洗至表面干凈（每片病葉單獨(dú)沖洗），再用裝有蒸餾水的喉頭噴霧器噴洗病葉表面，噴洗掉葉片表面殘留的霜霉病菌霉層，之后將其置于鋪有4層濕潤(rùn)紗布的瓷盤內(nèi)，葉片背面朝上，用浸濕的棉花包裹葉柄，濾紙吸干葉表面殘留的水珠，用保鮮膜封口，蓋上黑布置于常溫條件（20 ℃±2 ℃）下保濕培養(yǎng)24～36 h，等到病葉上產(chǎn)生新的白色霜霉層后[9]，供保存試驗(yàn)使用。

1.1.2 供試葡萄品種

金沙林場(chǎng)種植的高感霜霉病的品種‘紅地球’，采摘植株新生枝條的第3～5節(jié)健康葉片，用于不同保護(hù)劑、保存溫度和保存時(shí)間的霜霉病菌孢子囊接種用。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑為DMSO、液氮[10-11]和瓊脂粉，DMSO按所需的濃度配好后要先經(jīng)過(guò)滅菌再使用；所用植物培養(yǎng)箱的型號(hào)：MLR-352h-PC（日本三洋）；-20 ℃冰箱的型號(hào)：BCD-215TD GA（中國(guó)海爾）；-80 ℃超低溫保存箱的型號(hào)：DW-86L578J（中國(guó)海爾）。

1.2 方法

1.2.1 不同保護(hù)劑對(duì)葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影響

在經(jīng)過(guò)保濕培養(yǎng)后長(zhǎng)出新霉層的病葉中，挑選具有相似形狀和霉層厚度的病斑，用無(wú)菌剪刀將病斑剪成3等份，并用3種保護(hù)劑分別保存。第一種方法是將霜霉病菌單斑放入液氮中急速冷凍，取出后再將其置于1.5 mL的塑料離心管中；第二種是將霜霉病菌單斑放入1.5 mL的塑料離心管中，再放入瓊脂粉將其埋沒(méi)；第三種方法是將霜霉病菌單斑放入1.5 mL的塑料離心管中，再用5%二甲基亞砜將其浸沒(méi)。

1.2.2 不同保存溫度對(duì)霜霉病菌孢子囊存活的影響

將用3種保護(hù)劑處理后的霜霉病菌單斑分別保存于-20 ℃和-80 ℃的低溫下，120 d后取出后進(jìn)行葉盤回接，常規(guī)補(bǔ)水保濕，第7天調(diào)查發(fā)病情況并比較兩種低溫處理對(duì)孢子囊存活的影響。

1.2.3 不同保存時(shí)間對(duì)霜霉病菌孢子囊存活的影響

將3種保護(hù)劑處理后的霜霉病菌單斑均置于-80 ℃的超低溫冰箱保存，經(jīng)過(guò)30、60、90、120、180、360 d后取出進(jìn)行葉盤回接，常規(guī)補(bǔ)水保濕，第7天調(diào)查發(fā)病情況并比較不同保存時(shí)間對(duì)孢子囊存活的影響。

1.2.4 接種方法

將不同保護(hù)劑、不同保存溫度和不同保存時(shí)間儲(chǔ)存的霜霉病菌單斑取出后，先在室溫下緩慢解凍復(fù)蘇后，再用血球計(jì)數(shù)板將孢子囊配置成8×105個(gè)/mL的懸浮液進(jìn)行點(diǎn)滴接種，將采集回來(lái)的新鮮‘紅地球’健康葉片用蒸餾水清洗葉表面以除去灰塵和污物，在室溫條件下晾干，用直徑為15 mm的打孔器將其打成葉盤，葉背朝上置于鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿（直徑為18 cm）中，每處理10個(gè)葉盤，重復(fù)3次，每皿共計(jì)30個(gè)葉盤；用微量移液器在每個(gè)葉盤的中央滴加20 μL孢子囊懸浮液。接種后用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，在18～22 ℃、濕度90%以上的黑暗處保濕培養(yǎng)24 h，之后用吸水紙吸干葉盤上殘存的菌液，繼續(xù)12 h光暗交替培養(yǎng)7 d。所有上述試驗(yàn)均以相同菌株的新鮮孢子囊懸浮液接種為對(duì)照。

1.2.5 病情調(diào)查和統(tǒng)計(jì)

接種以后每天觀察發(fā)病情況，常規(guī)補(bǔ)水以保持葉盤濕潤(rùn)；接種7 d后（葉片發(fā)病后且病情不再擴(kuò)展），調(diào)查下列指標(biāo)：葉盤總面積和病斑總面積。發(fā)病情況表示為發(fā)病面積的百分比，病斑面積越大，說(shuō)明其保存的效果越好。使用DPS軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性分析。

發(fā)病面積百分率/%＝病斑總面積/葉盤總面積×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保護(hù)劑對(duì)霜霉病菌孢子囊存活的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），3種保護(hù)劑中以5% DMSO作保護(hù)劑在-80 ℃保存效果最好，30 d后取出復(fù)蘇回接，葉盤的發(fā)病面積百分率為69.32%，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異；其次是單斑病葉經(jīng)液氮快速冷凍處理后在-80 ℃保存，效果較差的是瓊脂粉包埋置于-80 ℃保存，回接葉盤發(fā)病面積百分為48.32%，與對(duì)照比具有顯著性差異。

2.2 不同保存溫度對(duì)霜霉病菌孢子囊存活的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），無(wú)論保存方法如何，在試驗(yàn)的兩個(gè)低溫條件下，霜霉病菌保存的致病效果在-80 ℃都是最好的。5% DMSO浸沒(méi)保存于-80 ℃、單斑病葉經(jīng)液氮冷凍-80 ℃保存和瓊脂粉包埋-80 ℃保存，120 d后用毛筆將孢子囊刷入無(wú)菌水中進(jìn)行葉盤回接，其發(fā)病面積百分率分別為58.56%、38.39%和31.97%，明顯高于-20 ℃的保存溫度。

表1 不同保護(hù)劑處理葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 1 Effects of preservation agents on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

表2 不同保存溫度下葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 2 Effect of preservation temperature on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

表3 不同保存時(shí)間下葡萄霜霉病菌孢子囊致病性Table 3 Effect of different preservation duration on sporangium pathogenicity of Plasmopara viticola

2.3 不同保存時(shí)間對(duì)霜霉病菌孢子囊存活的影響

將3種保護(hù)劑處理后的霜霉病菌單斑均置于-80 ℃低溫冰箱中，經(jīng)過(guò)30、60、90、120、180、360 d后取出進(jìn)行葉盤回接，結(jié)果表明（表3）：3種保護(hù)劑保存的葡萄霜霉病菌孢子囊均隨著時(shí)間延長(zhǎng)致病性明顯降低了。其中以5% DMSO處理后在-80 ℃低溫冰箱中的保存效果最佳，孢子囊的致病性能夠保持360 d以上且形態(tài)變化不大，采用該方法對(duì)上述不同保存時(shí)間的葡萄霜霉病菌孢子囊進(jìn)行葉盤回接，其發(fā)病面積分別占葉盤面積的69.32%、64.58%、61.36%、58.56%、43.03%和22.96%，明顯高于液氮和瓊脂粉的保存效果。

3 討論與結(jié)論

在本研究中選擇了兩種前人研究報(bào)道過(guò)的保護(hù)劑DMSO和液氮來(lái)保存葡萄霜霉病菌的孢子囊，針對(duì)霜霉病菌孢子囊的較長(zhǎng)期保存，成功探索出一種新的保護(hù)方式，即用瓊脂粉做保護(hù)劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的幾種保存方法中，以帶菌葉片經(jīng)5% DMSO浸沒(méi)處理后在-80 ℃低溫下保存效果最好，可以維持孢子囊的致病力達(dá)360 d以上，明顯高于在液氮和瓊脂中的保存效果，這與杜興蘭等[8]的研究結(jié)果基本一致，可以解決葡萄霜霉病菌因長(zhǎng)期離體導(dǎo)致致病力下降的問(wèn)題，分析其原因可能是由于DMSO有強(qiáng)烈吸濕性，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減少冰晶形成，減輕自由基對(duì)細(xì)胞損害，因此可用于用于除冰劑、涂料、各種乳膠的防凍劑、汽油、航煤的防凍劑，骨髓、血液、器官低溫保存的防凍劑。

由于DMSO具有一定的毒性，高揮發(fā)性濃度可引起頭痛和頭暈，可以灼傷皮膚并引起皮膚瘙癢；液氮是一種使人窒息的氣體，低溫會(huì)對(duì)人造成凍傷，不可與皮膚接觸；所以如果是短期保存（不超過(guò)90 d）的話，推薦使用瓊脂粉，實(shí)驗(yàn)室可就地取材，操作安全方便快捷，對(duì)設(shè)備要求也不高，具體使用何種保存方法，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況靈活控制。

對(duì)于離體孢子囊超低溫冷凍保存試驗(yàn)，有不少學(xué)者認(rèn)為，從低溫環(huán)境中取出后的解凍方式對(duì)其回接致病性存在一定影響。如Gill在研究蠶豆霜霉病菌離體保存的研究中，證明了常溫緩慢解凍對(duì)病原菌致病性影響最低[2]。因此本研究采用將孢子囊從低溫環(huán)境取出后，在室溫下緩慢融化后接種。本研究中只對(duì)孢子囊保存360 d后致病性進(jìn)行了研究，今后將繼續(xù)對(duì)離體的葡萄霜霉病菌孢子囊在DMSO、液氮、瓊脂粉或其他保護(hù)劑的不同保存時(shí)間的致病性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。