劉東奇

(南開(kāi)大學(xué) 物理科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

熒光顯微鏡在諸多領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用. 在物理方面，熒光顯微鏡在量子點(diǎn)和色心缺陷等零維材料、碳納米管和金屬納米線等一維材料、二硫化鉬和其他過(guò)渡金屬硫化物等二維材料、各類熒光晶體等三維材料的熒光特性研究中是必不可少的研究工具[1-4]；在生物、醫(yī)藥方面，觀察蛋白質(zhì)、DNA、生物細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)和探求作用機(jī)理，以及藥物顆粒傳輸、藥物作用效果時(shí)常用到的各類熒光標(biāo)記物都可以在熒光顯微鏡或性能優(yōu)異的超分辨熒光顯微鏡上觀測(cè)[5-7]. 目前，熒光顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域變得越來(lái)越廣泛，也是許多熱點(diǎn)研究問(wèn)題的有力表征手段，而相應(yīng)的光學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容還處于空白狀態(tài).

把熒光顯微鏡的基本原理、光路構(gòu)造、技術(shù)特點(diǎn)、實(shí)際應(yīng)用等方面綜合起來(lái)作為理工科學(xué)生、尤其是物理學(xué)科本科學(xué)生光學(xué)實(shí)驗(yàn)的一部分將是有益的嘗試. 本文設(shè)計(jì)了基于光學(xué)平臺(tái)的熒光顯微鏡自組實(shí)驗(yàn)，學(xué)生通過(guò)自行設(shè)計(jì)、光路搭建調(diào)節(jié)，組裝完成熒光顯微鏡設(shè)備，讓學(xué)生掌握熒光成像原理，優(yōu)化成像條件，完成熒光圖像和熒光光譜的采集.

1 熒光顯微鏡的設(shè)計(jì)和光路搭建

熒光顯微鏡的主要光學(xué)元件從大恒光電公司和索雷博公司購(gòu)置，安裝在支桿和底座組成的支架上，便于在光學(xué)面包板上調(diào)節(jié)光學(xué)元件的高度和位置.

熒光顯微鏡光路的搭建步驟為：

1)將激光器和白光光源置于光學(xué)面包板上的合適位置，通過(guò)調(diào)節(jié)各自支架的俯仰旋鈕，使激光光束和白光光束軸向平行且高度一致；

2)將一反射鏡鏡面調(diào)節(jié)到與白光光路成45°放置，將另一反射鏡放置于一維平移臺(tái)上，其鏡面與激光光路成45°，推開(kāi)平移臺(tái)時(shí)白光光束照射樣品，推入平移臺(tái)時(shí)激光光束照射樣品；

3)雙色鏡與入射光路成45°放置，入射光依次經(jīng)過(guò)雙色鏡、透鏡、物鏡后照射到裝載于三維手動(dòng)平移臺(tái)的樣品上，樣品受激發(fā)出的熒光經(jīng)雙色鏡透射進(jìn)入后方熒光采集光路；

4)將一反射鏡裝載于一維平移臺(tái)上，其鏡面與熒光光路成45°，推開(kāi)平移臺(tái)時(shí)熒光進(jìn)入后方的光譜儀完成光譜測(cè)量，推入平移臺(tái)時(shí)熒光進(jìn)入后方的CCD完成熒光圖像采集.

搭建的熒光顯微鏡主要光路如圖1所示. 所用反射鏡為鍍銀反射鏡，可見(jiàn)光區(qū)域的反射率大于95%；透鏡為凸透鏡，焦距為50 mm；所用熒光樣品為CdTe/CdS量子點(diǎn)，通過(guò)移液槍吸取50 μL濃度為0.2 mg/mL的量子點(diǎn)懸濁液，滴涂在170 μm厚度的石英載玻片上制備而成. 熒光顯微鏡采用反射式光路，激光和白光光束均通過(guò)物鏡照射到樣品上，樣品受激發(fā)射的熒光通過(guò)同一物鏡被后方熒光光路收集. 激光激發(fā)光路和白光照明光路可以通過(guò)裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)的反射鏡進(jìn)行光路的自由切換. 熒光收集光路可以通過(guò)裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)的反射鏡實(shí)現(xiàn)光譜探測(cè)光路和CCD成像光路的自由切換.

圖1 熒光顯微鏡光路圖

2 熒光顯微鏡性能測(cè)試

2.1 熒光顯微鏡光學(xué)分辨率測(cè)量

利用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)分辨率板在白光照明條件下測(cè)熒光顯微鏡的空間分辨能力. 將圖1中接入激光光束的反射鏡(裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)上)移開(kāi)，白光光束可照射到樣品上. 同時(shí)，將熒光光路中的反射鏡(裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)上)移入，CCD相機(jī)可采集圖像. 圖2是選用放大倍數(shù)40倍、數(shù)值孔徑為0.6的物鏡拍攝的標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)分辨率板的圖像. 組裝完成的熒光顯微鏡可分辨700 lp/mm的線對(duì)，相應(yīng)的光學(xué)分辨率為714 nm. 對(duì)于配備數(shù)值孔徑為0.6物鏡的該熒光顯微鏡，白光照明下其光學(xué)分辨率接近此處的光學(xué)衍射極限.

圖2 白光照明下熒光顯微鏡拍攝的 標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)分辨率板的圖像

2.2 熒光光譜測(cè)量和熒光圖像采集

熒光顯微鏡所配的光譜儀型號(hào)為海洋光學(xué)QE65000型光纖光譜儀，測(cè)量光源光譜時(shí)可以將光纖直接對(duì)準(zhǔn)光源光束進(jìn)行光譜采集，測(cè)量熒光光譜時(shí)可以直接接入熒光光路進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集. 學(xué)生在使用光纖光譜儀時(shí)，需要將光源強(qiáng)度調(diào)低，避免光強(qiáng)度超過(guò)光譜儀量程，長(zhǎng)時(shí)間采集時(shí)損壞儀器. 可以將接入光譜儀的一端光纖拔下對(duì)準(zhǔn)紙面通過(guò)肉眼觀察耦合進(jìn)入光纖的光源強(qiáng)度，將光源調(diào)節(jié)到合適強(qiáng)度后再將光纖一端接入光譜儀進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集. 圖3(a)是白光光源的光譜，光譜范圍400～1 050 nm. 圖3(b)是激光光譜和樣品的熒光光譜，激光波長(zhǎng)為561 nm，所用樣品為CdTe/CdS量子點(diǎn)，熒光范圍650～800 nm，熒光峰位于720 nm處.

(a)白光光源的光譜

(b)激光光譜和樣品的熒光光譜圖3 白光光源光譜和激光光源及相應(yīng)熒光光譜

將圖1中接入激光光束的反射鏡(裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)上)移入，白光光束被阻擋，激光光束可以照射到樣品上. 同時(shí)，將熒光光路中的反射鏡(裝載于一維手動(dòng)平移臺(tái)上)移入，CCD相機(jī)可以采集相應(yīng)熒光圖像. 圖4(a)是激光照射下拍攝的帶有十字型標(biāo)記的樣品的熒光圖像，圖中顏色為偽色，粉紫色區(qū)域熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，藍(lán)色區(qū)域熒光強(qiáng)度次之，綠色區(qū)域熒光強(qiáng)度較弱，紅色區(qū)域熒光強(qiáng)度最弱. 作為對(duì)比，圖4(b)是白光照明下拍攝的相同區(qū)域的樣品圖像. 從圖4中可以看到，白光照明圖像中的十字型標(biāo)記清晰可見(jiàn)，圖中白色區(qū)域?yàn)闊o(wú)量子點(diǎn)或量子點(diǎn)稀少的區(qū)域，灰色區(qū)域是量子點(diǎn)團(tuán)聚的區(qū)域. 熒光圖像和白光照明圖像中的十字型標(biāo)記形狀一致，熒光圖像中的十字型標(biāo)記主要呈現(xiàn)紅色，表明十字型標(biāo)記位置為無(wú)量子點(diǎn)或量子點(diǎn)稀少的區(qū)域；而熒光圖像兩側(cè)的紅色區(qū)域?yàn)榧す夤獍呶凑丈涞降膮^(qū)域或激光光斑強(qiáng)度極弱的區(qū)域，該區(qū)域不發(fā)出熒光或發(fā)出極弱的熒光，主要呈現(xiàn)紅色；熒光圖像中呈現(xiàn)粉紫色的區(qū)域是量子點(diǎn)團(tuán)聚程度最高的區(qū)域，熒光強(qiáng)度最高. 在白光照明圖像中各個(gè)量子點(diǎn)團(tuán)聚區(qū)域的內(nèi)部的襯度較為一致，內(nèi)部細(xì)節(jié)區(qū)別不明顯，而熒光圖像可以更為清晰地判斷白光照明圖像中襯度基本一致的區(qū)域內(nèi)哪些位置處的量子點(diǎn)分布更多，熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，尤其是量子點(diǎn)團(tuán)聚的點(diǎn)狀區(qū)域在熒光圖像中表現(xiàn)更為直觀.

(a)激光照射下拍攝的帶有十字型標(biāo)記的樣品熒光圖像

(b)白光照明下拍攝的相同區(qū)域的樣品圖像 圖4 樣品的熒光圖像及相同區(qū)域白光成像

2.3 改進(jìn)和拓展

自行設(shè)計(jì)、組裝的熒光顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定工作，其光路切換簡(jiǎn)單快捷. 除目前所用光譜儀價(jià)格較貴外，其他光學(xué)元件的經(jīng)濟(jì)成本都在可接受范圍. 對(duì)于光譜儀，可選用國(guó)產(chǎn)廠家的光纖光譜儀或普通光譜儀，價(jià)格便宜.

熒光顯微鏡自組實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)初衷是建立1套開(kāi)放式系統(tǒng)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要在后期的實(shí)際使用過(guò)程中自行加入其他光學(xué)模塊實(shí)現(xiàn)相應(yīng)功能，比如加入多路激光光路、偏振光路等.

3 結(jié)束語(yǔ)

基于光學(xué)平臺(tái)的光學(xué)自組實(shí)驗(yàn)，學(xué)生將通過(guò)自行設(shè)計(jì)熒光顯微鏡光路，組裝集白光照明成像、激光激發(fā)熒光成像、熒光光譜探測(cè)等功能于一體的開(kāi)放式系統(tǒng). 整個(gè)系統(tǒng)原理簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)緊湊，與前沿科學(xué)研究聯(lián)系更為緊密，適合于作為理工科尤其是物理學(xué)科本科生的光學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容. 該實(shí)驗(yàn)可以讓學(xué)生完成基本光路調(diào)節(jié)的技能培養(yǎng)和熒光顯微鏡基本原理等知識(shí)的獲取，學(xué)生還可以進(jìn)一步根據(jù)需要擴(kuò)展此系統(tǒng)的功能，完成探究型物理實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容.