常云霞，李姿琳，李芙蓉

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益嚴(yán)重．據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)鎘污染農(nóng)田面積高達(dá)2.0×105hm2，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1-3]．土壤中的Cd具有較強(qiáng)的移動(dòng)性，被植物根部吸收后轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部累積，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人和動(dòng)物體，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極大的危害[4]．近年來(lái)，如何解決Cd污染土壤的耕種問(wèn)題已受到廣泛關(guān)注．研究表明在污染條件下，通過(guò)施加外源物質(zhì)可以緩解或抑制 Cd對(duì)植物的毒害作用[3]．?dāng)M南芥作為模式植物，具有生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，這為研究植物生命活動(dòng)提供了有利條件[5]．因此，明確Cd對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響及探討緩解Cd脅迫的途徑具有重要意義．

吲哚乙酸(IAA)是生長(zhǎng)素類(lèi)植物生長(zhǎng)物質(zhì)，影響細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化，也影響植物的生長(zhǎng)、成熟和衰老[6]．近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)IAA與植物的抗重金屬性有密切聯(lián)系，可以提高Cd2+脅迫下擬南芥幼苗的根長(zhǎng)以及油菜的株高[7]，促進(jìn)紫花苜蓿、滇苦菜和東南景天對(duì)鉛的吸收作用[8-10]，促進(jìn)大葉井口邊草對(duì)砷的吸收作用[11]，降低鋁對(duì)紫花苜蓿的毒害作用[12]．目前，關(guān)于采用外施IAA緩解Cd2+脅迫對(duì)擬南芥幼苗毒害作用的研究報(bào)道卻較少，因此本實(shí)驗(yàn)以模式植物擬南芥為材料，選擇1 μmol·L-1IAA預(yù)處理研究其對(duì)擬南芥植株鎘脅迫生理的影響，從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性等幾個(gè)方面分析IAA緩解擬南芥植株鎘脅迫生理的潛在機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)供試材料為哥倫比亞野生型擬南芥(Col-0)，由周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種實(shí)驗(yàn)室提供．采用基質(zhì)培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)容器為70 mm× 70 mm× 70 mm的塑料盒，培養(yǎng)溶液為MS大量營(yíng)養(yǎng)液．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

擬南芥播種在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，所用器皿及試劑均已滅菌．?dāng)M南芥種子先用75%乙醇表面消毒1 min，再用2.5%次氯酸鈉溶液消毒8 min，無(wú)菌水重洗3～5次，用移液器將種子均勻播種在裝有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約100～200粒種子．4 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)春化2～3 d后轉(zhuǎn)移到25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，等幼苗長(zhǎng)至2葉1芯時(shí)選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的將其移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的塑料盒中進(jìn)行培養(yǎng)，每盒4棵，每托盤(pán)12盒．每天上午8時(shí)給幼苗澆灌MS大量營(yíng)養(yǎng)液，每棵約5 mL，并在托盤(pán)底部補(bǔ)充蒸餾水．培養(yǎng)15 d后開(kāi)始實(shí)施脅迫處理．

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1 μmol·L-1IAA具有緩解Cd2+毒害作用，故本實(shí)驗(yàn)將幼苗分為四個(gè)處理組，第一組為對(duì)照(CK)，處理液為MS大量營(yíng)養(yǎng)液；第二組為IAA，處理液為1 μmol·L-1IAA+MS大量營(yíng)養(yǎng)液；第三組為CdCl2，處理液為100 mg·L-1CdCl2+MS大量營(yíng)養(yǎng)液；第四組為IAA+CdCl2，處理液為1 μmol·L-1IAA+100 mg·L-1CdCl2+MS大量營(yíng)養(yǎng)液．脅迫6、8、10 d 后，收獲植株測(cè)定相關(guān)指標(biāo)．

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

取擬南芥葉片，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[13]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[14]，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定[13]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[13]，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定[13]，POD活性采用愈刨木酚法測(cè)定[14]，CAT的活性采用紫外吸收法測(cè)定[13]．

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每種處理組3次重復(fù)，采用 Microsoft Office Excel 2013處理數(shù)據(jù)、圖表，用SPSS 16.0對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，采用Duncan test．差異顯著水平設(shè)置為α= 0.05．

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.1.1 對(duì)Pro含量的影響

注：圖柱上小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性，下圖同

脯氨酸(Pro)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量增加可能是植物對(duì)重金屬的耐受機(jī)制之一[15-16].如圖1所示，鎘脅迫期間，對(duì)照組和IAA 處理組擬南芥葉片內(nèi)Pro含量無(wú)明顯差異；Cd2+脅迫處理組Pro含量則顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，并隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而升高，與脅迫第6 d相比Pro含量增加了21.12%與51.86%；與Cd2+脅迫組相比，IAA+Cd2+處理組擬南芥葉片內(nèi)脯氨酸含量又顯著增加(p<0.05)，增幅為18.01%～28.15%，說(shuō)明外施IAA能顯著提高擬南芥葉片內(nèi)的Pro含量，緩解Cd2+脅迫對(duì)擬南芥的傷害作用．

2.1.2 對(duì)可溶性蛋白含量的影響

圖2 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

如圖2所示，Cd2+脅迫處理組可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，并隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而升高；IAA+Cd2+處理組擬南芥可溶性蛋白含量與Cd2+脅迫組相比增加了 24.8%～19.2%(p<0.05)．說(shuō)明IAA處理能有效提高擬南芥體內(nèi)的可溶性蛋白含量，并通過(guò)蛋白與重金屬鎘的螫合來(lái)降低體內(nèi)的鎘含量，從而達(dá)到減少重金屬鎘脅迫造成的損傷[17-18]．

2.1.3 對(duì)可溶性糖含量的影響

圖3 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體內(nèi)主要滲透調(diào)節(jié)劑，對(duì)細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體有穩(wěn)定作用，在重金屬脅迫下，植物可以通過(guò)在體內(nèi)積累可溶性糖的方式來(lái)降低水勢(shì)，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化[19]．如圖3所示，Cd2+脅迫后可溶性糖含量顯著高于對(duì)照(p<0.05)，并隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加； IAA+Cd2+處理組擬南芥可溶性糖含量與Cd2+脅迫組相比顯著增加了3.3%～11.6%．說(shuō)明 IAA處理能促使擬南芥植株積累較多的游離脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖，從而緩解鎘脅迫造成的毒害作用．

2.2 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)MDA含量的影響

圖4 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)MDA含量的影響

生物體內(nèi)的氧自由基會(huì)攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，可以反映細(xì)胞受自由基損傷的程度，常用于衡量重金屬的毒性[20]．如圖4所示，Cd2+脅迫后擬南芥葉片內(nèi)MDA含量顯著高于對(duì)照(p<0.05)，并隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加； IAA+Cd2+處理組擬南芥MDA含量與Cd2+脅迫組相比顯著降低了7.1%～12.39%．說(shuō)明 IAA預(yù)處理能緩解鎘脅迫下擬南芥脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而降低鎘的傷害．

2.3 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)抗氧化酶活性的影響

2.3.1 對(duì)SOD活性的影響

圖5 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)SOD活性的影響

SOD是植物內(nèi)重要的保護(hù)酶，能有效清除活性氧自由基(ROS)．如圖5所示，Cd2+脅迫處理后擬南芥葉片內(nèi)SOD活性顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，但隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而有所增加；IAA+Cd2+處理組擬南芥SOD活性與Cd2+脅迫組相比增加了10%～4.35%．說(shuō)明 IAA預(yù)處理能增加SOD活性，從而有效清除擬南芥體內(nèi)ROS，減少對(duì)細(xì)胞的傷害．

2.3.2 對(duì)POD活性的影響

POD酶是植物體內(nèi)重要的一類(lèi)過(guò)氧化物酶，其活性高低與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等密切相關(guān)[21]．如圖6所示，Cd2+脅迫處理組POD活性與對(duì)照組相比顯著下降(p<0.05)，但隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而又顯著增加；IAA+Cd2+處理組擬南芥POD活性與Cd2+脅迫組相比增加了9.3%～7.04%．表明外源IAA可有效增加葉片內(nèi)POD活性，降低鎘毒害作用．

圖6 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)POD活性的影響

2.3.3 對(duì)CAT活性的影響

CAT是植物抵御多種逆境脅迫的重要酶類(lèi)，與SOD相互協(xié)調(diào)消除超氧陰離子，防止細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生過(guò)氧化，從而增強(qiáng)植物抗逆能力[22]．如圖7所示，Cd2+脅迫處理后CAT活性顯著低于對(duì)照(p<0.05)，但隨Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)則顯著增加；IAA+Cd2+處理組擬南芥CAT活性與Cd2+脅迫組相比增加了20.97%～24.6%．由此可以推測(cè)出，外施IAA可有效使擬南芥通過(guò)表達(dá) CAT緩解鎘的毒害效應(yīng)．

圖7 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)CAT活性的影響

3 討論

3.1 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

Pro、可溶性糖及可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑，具有保護(hù)蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的完整性以及清除ROS等功能，在保護(hù)植物細(xì)胞免受鎘脅迫傷害中起到非常重要的作用[23-24]．本實(shí)驗(yàn)中隨著Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，擬南芥體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著增加；外施1 μmol·L-1IAA后，顯著增強(qiáng)了游離Pro、可溶性糖及可溶性蛋白的含量，可能是與外源IAA能有效緩解Cd2+脅迫對(duì)擬南芥幼苗葉片的非氣孔限制因素，提高葉片的光合能力，促進(jìn)光合產(chǎn)物的合成和積累有關(guān)[4]．說(shuō)明適宜濃度的IAA處理可有效減輕重金屬Cd2+脅迫的毒害．

3.2 IAA對(duì)鎘脅迫期間擬南芥葉片內(nèi)抗氧化酶活性的影響

鎘具有很強(qiáng)的毒性，較其他重金屬更容易為農(nóng)作物、蔬菜、稻米所吸收，對(duì)生物有機(jī)體產(chǎn)生較大的毒性．Cd離子進(jìn)入植物體后會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，引起ROS代謝失衡，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，使植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)遭受不同程度的損害，進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]．當(dāng)植物受到外界非正常的生存環(huán)境時(shí)，其本身為了防御大量的ROS的傷害，自身會(huì)形成一整套完善的抵御體系[26]．植物可以通過(guò)體內(nèi)的SOD、POD、CAT等抗氧化酶系統(tǒng)清除自由基，以應(yīng)對(duì)外界的逆境脅迫，在形成應(yīng)答的過(guò)程中，這些酶的活性會(huì)因脅迫和處理時(shí)間的不同而不同．本試驗(yàn)中，SOD、POD、CAT活性的變化趨勢(shì)基本一致，SOD是植物體內(nèi)清除ROS的第一道防線，將·O2-轉(zhuǎn)化成O2和H2O2，進(jìn)而阻斷·O2-對(duì)細(xì)胞造成的傷害，POD和CAT的主要作用是清除植物體內(nèi)的H2O2[27]．Cd2+脅迫下外施IAA后擬南芥幼苗葉片中SOD、POD、CAT活性都明顯上升，說(shuō)明擬南芥幼苗通過(guò)產(chǎn)生大量的抗氧化酶來(lái)抵抗逆境，使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，順利度過(guò)不良環(huán)境．而0.1 μmg/L IAA處理可以明顯增強(qiáng)SOD、POD、CAT活性，緩解Cd2+對(duì)擬南芥幼苗的危害，可以增強(qiáng)植物的抗氧化酶系統(tǒng)能力．