汪超甲 王輝

[摘要] 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前的手術(shù)、化療、放療效果欠佳，基因治療可能成為未來腦膠質(zhì)瘤的重要發(fā)展方向。現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)有RNA干擾、TALEN、ZENs等，由于其設(shè)計(jì)操作復(fù)雜且脫靶率高，一直沒能得到很好的應(yīng)用。（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)。通過對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫，較上述的幾種方法，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本文就CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)功能及在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用作一綜述，以期為腦膠質(zhì)的治療提供新途徑。

[關(guān)鍵詞] CRISPR/Cas9；結(jié)構(gòu)功能；腦膠質(zhì)瘤；應(yīng)用進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（c）-0024-04

[Abstrict] Glioma is the most common primary malignant tumor of the brain. Currently， surgery， chemotherapy and radiotherapy are not effective. Gene therapy may become an important development direction of glioma in the future. The existing gene editing techniques have RNA interference， TALEN， ZENs and so on. Because of their complex design operation and high miss distance， they have not been used well. （CRISPR） /CRISPR-associated （Cas） 9 is a natural immune system for many bacteria and most of the palaeophytes. By specific identification of the invaded virus and nucleic acid， the Cas protein is used to cut the virus to achieve its own immunity. Compared with the above methods， it has obvious advantages. This article reviews the structure and function of CRISPR/Cas9 and its application in the treatment of glioma， in order to provide a new therapeutic approach for the treatment of brain glia.

[Key words] CRISPR/Cas9； Structural function； Glioma； Application progress

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率及惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤。由于其發(fā)病機(jī)制不詳，不能得到徹底治愈。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生、發(fā)展和多因素、多基因的共同作用密切相關(guān)[1]。為了能夠徹底治愈，就必須明確這些基因、因素的作用機(jī)制以及它們之間的相互作用，基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展使得其成為可能。RNA干擾技術(shù)可以將目的基因沉默，使其功能減低，來研究基因在疾病中的作用。TALEN和ZFNs技術(shù)則通過對(duì)目標(biāo)基因的相應(yīng)片段進(jìn)行敲除，使基因功能徹底喪失，進(jìn)一步明確該基因的作用。CRISPR/Cas是新近發(fā)展起來的第3代基因編輯工具，可以對(duì)單基因或者多基因同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)的插入、敲除、替換，更為簡單、高效，并很快成為研究熱點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于腫瘤及遺傳性疾病的研究中。本文從CRISPR/Cas的發(fā)現(xiàn)歷史、結(jié)構(gòu)功能、作用機(jī)制及應(yīng)用，及其在腦膠質(zhì)中的應(yīng)用進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)，也為從基因角度治愈腦膠質(zhì)瘤帶來曙光。

1 CRISPR/Cas的發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas全稱多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白，是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。早在1987年，日本科學(xué)家在對(duì)細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶研究時(shí)就發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)間隔重復(fù)序列，但其功能一直未解[2]。直到2002年，這種序列才廣泛在細(xì)菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)，由此命名為CRISPR系統(tǒng)[3]。CRISPR/Cas9最早在乳酸菌中發(fā)現(xiàn)。2005年，有3個(gè)研究組同時(shí)發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列和外源pageDNA片段及侵染細(xì)菌的病毒具有高度同源特性。從而判斷，這可能是類似siRNA免疫防御一樣，是細(xì)菌抵抗外源page片段的一種機(jī)制。2013年這一系統(tǒng)在《Cell》被報(bào)道后[4]，至此，CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸被認(rèn)識(shí)并應(yīng)用于各種研究領(lǐng)域。

2 CRISPR/cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)總共分為三類，CRISPR/cas9是其中第二類，應(yīng)用最為廣泛[5]。除共有的基因Cas1和Cas2外，只需要一種CRISPR相關(guān)蛋白即Cas9蛋白；而一類和三類的標(biāo)記基因分別為Cas3和Cas10，除此之外還需要多種相關(guān)Cas蛋白，所以相對(duì)來說CRISPR/cas9結(jié)構(gòu)更加簡單，應(yīng)用更加普遍[6]。CRISPR-Cas通常由識(shí)別和切割功能的兩個(gè)重要部分組成。CRISPR位點(diǎn)由短的高度保守的重復(fù)序列組成，重復(fù)序列的長度一般為21～48 bp，之間被26～72 bp間隔序列隔開。不同細(xì)菌具有不同的重復(fù)序列及間隔序列，呈多樣性。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進(jìn)行識(shí)別。而切割部分cas蛋白存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，能夠分開切割雙鏈DNA的兩條核苷酸單鏈，即由gRNA引導(dǎo)并對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。各類CRISPR-cas的剪切位點(diǎn)通常位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)。不同類型的CRISPR-cas系統(tǒng)有著各自的PAM序列。就二型來說Cas蛋白由cas9單獨(dú)構(gòu)成，其PAM區(qū)以5′-GG-N18-NGG-3′為典型特征。在人類基因組中，平均每隔128 bp就出現(xiàn)1個(gè)NGG PAM，為靶點(diǎn)選擇提供了方便[7]。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制

CRISPR/Cas9作用機(jī)制可分為3個(gè)階段：適應(yīng)階段、表達(dá)階段和干擾階段[8]。

適應(yīng)階段：當(dāng)宿主菌受外源物質(zhì)入侵后，外源質(zhì)?；蚴删w上的一小段DNA序列會(huì)以非同源重組的方式被整合到宿主菌的基因組中，整合的位置位于前導(dǎo)序列與第一個(gè)重復(fù)序列之間[9]，且每插入一段外源序列都會(huì)伴隨著一次重復(fù)序列的復(fù)制，從而形成新的R-S結(jié)構(gòu)。這一過程使得宿主CRISPR含有外源序列信息，為干擾階段發(fā)揮作用提供基礎(chǔ)。宿主對(duì)外源DNA序列的選擇也并非隨機(jī)的，有研究發(fā)現(xiàn)在前間區(qū)序列附近含有一些特定序列稱為前間區(qū)序列鄰近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs）[10]，不同CRISPR亞型對(duì)于PAM的識(shí)別具有特異性。

表達(dá)階段：CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成一段長鏈的RNA，稱為CRISPR RNA前體（Pre-crRNA），同時(shí)Cas蛋白將形成一個(gè)具有內(nèi)切酶功能的復(fù)合物，特異性地將crRNA切割加工成小的成熟crRNA。成熟的crRNA會(huì)與Cas蛋白復(fù)合物結(jié)合形成具有特殊功能的Cas/crRNA作用復(fù)合體，在干擾階段發(fā)揮作用[9]。

干擾階段：當(dāng)宿主再次接觸到外界噬菌體或質(zhì)粒時(shí)，crRNA便會(huì)與其同源的外源核酸特異性結(jié)合，而后通過Cas/crRNA作用復(fù)合體將外源核酸切割成碎片，使其無法行使功能，從而達(dá)到保護(hù)宿主基因組的目的[9]。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

4.1 原始的Cas9介導(dǎo)的基因編輯

此過程主要分為兩步：①在特定的區(qū)域由crRNA中的20nt的靶位對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行識(shí)別，而后被Cas9切割產(chǎn)生DB S[11]。②由修復(fù)系統(tǒng)對(duì)DBS進(jìn)行修復(fù)。主要有NHEJ和HDR兩種修復(fù)方式。NHEJ作為有錯(cuò)誤傾向的過程，經(jīng)常產(chǎn)生非限制性的小的插入或者缺失，從而導(dǎo)致功能的異常。HDR修復(fù)則表現(xiàn)為精確的編輯，它們會(huì)產(chǎn)生限制性的缺失、插入或者是核酸的替代[12]。在此之前，首先它們要在外來的宿主中表達(dá)。不同物種、不同組織器官表達(dá)差異很大[13]。

4.2 核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯

伴有RUVC和HNH突變的RNA指導(dǎo)的Cas9n具有在目標(biāo)區(qū)產(chǎn)生的是單切口[14]。這種切口可以通過HDR途徑非常成功的進(jìn)行修復(fù)編輯[15]。引入一對(duì)gRNA指導(dǎo)性的CAS9n產(chǎn)生的DSBs可以通過NHEJ產(chǎn)生突變，較單一的Cas9n介導(dǎo)的HDR效率顯著提高，且可以改善人類細(xì)胞的脫靶率高達(dá)50～1500倍。因?yàn)殡p切口產(chǎn)生的可預(yù)測(cè)的有限制黏性末端，通過NHEJ介導(dǎo)的連接，可以提供有兼容的突出末端的雙鏈修復(fù)模板，也可以成功的將HDR非依賴的片段在特定區(qū)域整合[13]。因此利用Cas9n多個(gè)切口的產(chǎn)生可以進(jìn)行更高精準(zhǔn)度的基因編輯[13]。

4.3 非活化的Cas9為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

CRISPR/Cas系統(tǒng)也被發(fā)展成為在不改變目標(biāo)基因序列的基礎(chǔ)上的一種新型的便捷的多種途徑重復(fù)使用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，被稱作CRISPR干擾[16]。由完全滅活的dCas9和特定的gRNA（或者是tracrRNA：crRNA復(fù)合體）組成。它雖失去了核酸內(nèi)切酶的活性，但與gRNA結(jié)合和與目標(biāo)序列的綁定的能力并不受影響。和RNAi一樣，其取決于堿基配對(duì)的互補(bǔ)性對(duì)目標(biāo)部位的識(shí)別。RNAi主要引起轉(zhuǎn)錄本的降解和或者翻譯的受阻。但是CRSPRi阻止了轉(zhuǎn)錄的起始和延伸[17]。通過設(shè)計(jì)多對(duì)gRNA，使同時(shí)調(diào)節(jié)多基因成為可能。dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在肺炎鏈球菌中得到驗(yàn)證，聯(lián)合兩個(gè)gRNA同時(shí)作用同一基因可能使沉默效率達(dá)到1000倍。因此，CRISPRi在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)是非常有前景的通用方法。

4.4 以Cas9為基礎(chǔ)的高通量正向遺傳篩查

截至目前，所有以Cas9為基礎(chǔ)的工具都顯示出有強(qiáng)大的加強(qiáng)各種遺傳及合成生物學(xué)的能力。鑒于此，利用多功能的Cas9各種相關(guān)產(chǎn)物創(chuàng)建突變庫，用來檢測(cè)或者鑒定與遺傳要素有關(guān)的基因譜的表現(xiàn)型是非常有可能的[18]。為了得到高通量的目標(biāo)序列，構(gòu)建高度特異性的gRNA庫是非常重要的。讓原始的Cas9和gRNA在宿主中共表達(dá)可以產(chǎn)生丟失功能的突變庫[19]。如果dCas9或者有Cas9效應(yīng)的嵌合體被應(yīng)用，可以產(chǎn)生基因敲低或者激活引起突變。相比于失去功能的突變庫，這些突變?cè)谘芯恐滤阑蛏嫌须y以比擬的優(yōu)勢(shì)[20]。

4.5 CR.ISPR/Cas9應(yīng)用的影響因素

影響Cas9基因編輯工具效率和特異性的因素眾多。比如：Cas9的活性、RNA組成的長度和結(jié)構(gòu)、Cas9/RNA的比例、RNA目標(biāo)序列的互補(bǔ)程度和互補(bǔ)的部位。熟悉這些影響因素有助于指導(dǎo)和改進(jìn)以后CRISPR的實(shí)驗(yàn)[21]。

4.6 與其它基因編輯工具的比較

用來基因靶向編輯和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工具根據(jù)它們靶向識(shí)別的機(jī)制，被分成針對(duì)特異性蛋白和核苷酸兩大組。鋅指和TALENs是眾所周知的方法。較上述方法Cas9具有以下優(yōu)勢(shì)：①只需合成1個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。②編碼sgRNA的序列不超過100 bp，比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡單方便。③較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。但是，它同樣存在脫靶的局限性，為了提高Cas9為基礎(chǔ)的工具效率和特異性，更需要在Cas9工程、優(yōu)化gRNA選擇規(guī)則中付出力度，并進(jìn)一步闡明Cas9基因組識(shí)別特征。

5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

隨著對(duì)該編輯系統(tǒng)的深入了解，人們開始不斷將其應(yīng)用于對(duì)腦膠質(zhì)瘤的研究方面。通過體內(nèi)、體外敲除腦膠質(zhì)瘤中的EGFR，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9對(duì)于富含EGFR或者是EGFR突變的患者來說都具有很好的治療前景[22]；同時(shí)敲除小鼠大腦中Trp53、Pten、Nf1等基因可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)這些抑癌基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用[23]；對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中特定基因的敲除，再次證實(shí)了了腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的種子[24]；MiR-10b及MiR24-3p基因的敲除揭示了MiR參與調(diào)控了腦膠質(zhì)瘤的增殖及侵襲的特性[25]；轉(zhuǎn)座子PiggyBac與CRISPR/Cas9的結(jié)合使得腦膠質(zhì)瘤中的突變可能得到糾正[26]；高通量正向篩查為腦膠質(zhì)瘤化療耐藥的篩選提供了更便捷的方法[27]，通過對(duì)腦膠質(zhì)細(xì)胞中CXCR4及PYK2等基因的敲除，發(fā)現(xiàn)這些基因在腦膠質(zhì)細(xì)胞的生長、遷移及侵襲能力的影響方面發(fā)揮著重要作用，敲除這些基因后細(xì)胞的生長、遷移、侵襲能力較野生型細(xì)胞明顯下降。不同級(jí)別的腦膠質(zhì)有著不同的基因突變類型，同一級(jí)別不同患者之間也存在著不同遺傳基因的突變，依據(jù)這些突變可以將膠質(zhì)瘤分為不同的基因亞型，不同亞型之間的預(yù)后存在差異，估要想做到個(gè)體化治療，必須先了解患者的基因亞型?？傊迷摼庉嬒到y(tǒng)，可以對(duì)腦膠質(zhì)瘤中的特定基因或者多個(gè)進(jìn)行精準(zhǔn)的編輯，探討其功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，也可以利用轉(zhuǎn)座子或者引入模板序列對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，還可以進(jìn)行大量藥物的篩選，為腦膠質(zhì)瘤的綜合治療提供非常重要的幫助，為開發(fā)新藥提供理論基礎(chǔ)。

6 小結(jié)

Cas9具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，是目前廣泛使用的靶向工具不能比擬的。它大大提高在不同的生物體中設(shè)計(jì)和編輯基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的能力；為更容易區(qū)分出個(gè)體化基因功能鋪平了道路；也將加快對(duì)體內(nèi)冗長的基因的功能和表觀遺傳學(xué)研究；使得多基因的編輯變得更高效、簡單，應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛。盡管以Cas9為基礎(chǔ)的研究工具已被應(yīng)用在許多模型生物中，但包括分子結(jié)構(gòu)和Cas9的催化機(jī)制，PAM的依賴性和gRNA加載機(jī)制的幾個(gè)基本屬性尚不清楚。了解這些問題將有助于使Cas9編輯工程獨(dú)立于PAM之外，擴(kuò)大我們的選擇目標(biāo)，并產(chǎn)生高度精確的Cas9 gRNA的復(fù)合物，特別是用作人類治療劑。目前所面臨的主要挑戰(zhàn)是脫靶的控制。上述工具是解決這一問題有效的方法[28]。此外，通過高通量的方法全面分析脫靶事件將有助于建立目標(biāo)序列的選擇規(guī)則、設(shè)計(jì)和編寫程序。以下幾個(gè)方面尚需要進(jìn)一步評(píng)估包括：①GC含量和設(shè)計(jì)的gRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，Cas9/gRNA分子在編輯和沉默效率、特異性上的比率；②不同輸送系統(tǒng)激活Cas9的效果和不同細(xì)胞中g(shù)RNA的組成；③NHEJ和HDR介導(dǎo)的DSB修復(fù)在不同生物中的普遍性和有效性，尤其是在細(xì)菌中；④Cas9為基礎(chǔ)的工具，基于高通量的前遺傳學(xué)研究的潛在的應(yīng)用[29]。該工具在腦膠質(zhì)基因治療方面的研究和利用尚處在初始階段，要充分了解Cas9為基礎(chǔ)的工具并將它們廣泛應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的臨床治療尚需花費(fèi)更多的精力。

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