王果 李煥苓 吉訓(xùn)志 王家保

摘 要 研究了不同濃度的IAA和ABA組合對(duì)不同荔枝品種體胚成熟的影響。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基中添加IAA和ABA對(duì)‘紫娘喜體胚成熟無明顯作用，體胚均未萌發(fā)，但有利于‘妃子笑體胚成熟?！有w胚在附加0.5 mg/L IAA與1.0 mg/L ABA的培養(yǎng)基上萌發(fā)效果最佳，多為單莖胚，萌發(fā)率最高，達(dá)59.6%；植株生長(zhǎng)健壯，顏色深綠，展葉率最高，達(dá)38.6%；根系良好，多分根，生根率達(dá)62.1%。

關(guān)鍵詞 荔枝 ；胚性愈傷組織 ；體胚發(fā)生 ；再生植株

中圖分類號(hào) S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.002

Abstract Somatic embryos from different cultivars of litchi （Litchi chinensis Sonn.） were treated with combinations of IAA and ABA at different concentrations to observe their maturity. The results showed that the addition of IAA and ABA in the culture medium had no obvious effect on the maturation of the somatic embryos of litchi cultivar‘Ziniangx， and failed to induce the germination of the somatic embryos， but was conducive to maturation of the litchi cultivar ‘Feizixiao. The best effect occurred in the medium supplemented with 0.5 mg/L of IAA and 1 mg/L of ABA for‘Feizixiao， and most of the somatic embryos were developed into a single stem with the highest germination rate of 59.6%. The plantlets were dark green， and grew better with the highest leaf emergence rate （upto 38.6%）. The plantlets were well rooted with numerous lateral roots， and the rooting rate was up to 62.1%.

Keywords litchi （Litchi chinensis Sonn.） ； embryogenic callus ； somatic embryogenesis ； plant regeneration

高效離體再生技術(shù)體系是轉(zhuǎn)基因技術(shù)開發(fā)的基礎(chǔ)。關(guān)于荔枝轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究報(bào)道較少，瓶頸在于未能建立高效、穩(wěn)定的離體再生技術(shù)體系。體胚發(fā)生是植物離體再生的重要途徑，而對(duì)于多數(shù)木本植物而言，體胚的成熟和萌發(fā)是建立體胚離體再生技術(shù)體系時(shí)的主要難題[1]，大部分木本植物從體胚發(fā)生到萌發(fā)還需經(jīng)過體胚成熟階段。林秀蓮等[2]認(rèn)為，龍眼從體胚發(fā)生到萌發(fā)階段需要至少2個(gè)月的時(shí)間，方可形成正常苗。沈慶斌等[3]指出，枇杷子葉胚需經(jīng)過高糖成熟培養(yǎng)后才可形成苗。滕世云等[4]發(fā)現(xiàn)，枇杷子葉胚只能發(fā)育至蝌蚪狀苗，隨后變褐、停止發(fā)育，可能與其未經(jīng)過體胚成熟階段有關(guān)。在前人先后建立的‘妃子笑等15個(gè)荔枝品種的離體再生技術(shù)體系中，體胚均經(jīng)過成熟培養(yǎng)[5-16]，但仍存在體胚萌發(fā)率低的難題，原因可能是畸形胚過多。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于花藥的‘妃子笑、‘紫娘喜荔枝胚性愈傷組織易于誘導(dǎo)出體胚，‘妃子笑體胚發(fā)生數(shù)量巨大，但高度不同步且體胚形狀、大小差別較大；‘紫娘喜次生胚產(chǎn)生率較高。體胚發(fā)生不同步、畸形胚及次生胚的產(chǎn)生在一定程度上抑制了體胚的正常成熟與萌發(fā)。大量研究[17-18]證明，IAA、ABA 2種激素對(duì)體胚的發(fā)生及成熟起正向促進(jìn)作用。傅連芳等[5]、呂柳新等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的IAA能在較短時(shí)間內(nèi)促使荔枝胚狀體增大。ABA被廣泛用于促進(jìn)針葉樹子葉胚發(fā)育成熟的培養(yǎng)基中[19]。有報(bào)道認(rèn)為，ABA能有效控制芒果[20]、葡萄[21]等畸形胚的產(chǎn)生。本研究擬探討不同濃度IAA和ABA組合對(duì)不同荔枝品種體胚成熟的影響，以期為建立高效、穩(wěn)定的荔枝離體再生技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

‘妃子笑和‘紫娘喜胚性愈傷組織分別為2015年春和2013年春以花藥為外植體經(jīng)誘導(dǎo)、篩選所得。

1.2 方法

1.2.1 體胚的誘導(dǎo)、成熟與萌發(fā)

將‘妃子笑和‘紫娘喜胚性愈傷組織分別接種在附加5 mg/L ZT、100 mL/L椰汁、0.4 g/L水解乳蛋白與0.1g/L肌醇的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚發(fā)生[16]。

待體胚發(fā)生約45 d時(shí)，選取直徑為0.8～1.5 cm的各類型體胚接種到附加不同濃度激素（IAA和ABA）的MS培養(yǎng)基（表1）中暗培養(yǎng)75 d，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，之后轉(zhuǎn)接于1/2 MS的萌發(fā)培養(yǎng)基上，以10 000lx光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃；培養(yǎng)60 d時(shí)觀察、記錄各項(xiàng)指標(biāo)，了解IAA和ABA不同濃度組合對(duì)體胚成熟及萌發(fā)的影響。每個(gè)處理接種20瓶（共約90個(gè)體胚），每1瓶為1次重復(fù)，即每處理重復(fù)20次。

根據(jù)萌發(fā)胚所抽莖數(shù)目多少將萌發(fā)胚分為單莖胚、多莖胚與玻璃化苗胚，單莖胚即為僅抽出一條單莖的體胚，多莖胚為抽出多條莖段的體胚，玻璃化苗胚為抽莖或者抽葉玻璃化的體胚。

根據(jù)萌發(fā)胚是否展葉分為展葉胚與無葉胚，展葉胚即具有完整葉片的體胚，無葉胚即僅僅抽出莖段但未展開葉片的體胚。

單莖胚率=單莖胚數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)×100%；

多莖胚率=多莖胚數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)×100%；

玻璃化苗胚率=玻璃化苗胚數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)×100%；

展葉胚率=展葉胚數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)×100%；

無葉胚率=無葉胚數(shù)/萌發(fā)胚數(shù)×100%；

萌發(fā)率=萌發(fā)胚數(shù)/接種體胚總數(shù)×100%；

生根率=生根胚數(shù)/接種體胚總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每處理20次重復(fù)，取各平均值，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[22]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 體胚發(fā)生、成熟與萌發(fā)的形態(tài)觀察

胚性愈傷組織在體胚發(fā)生培養(yǎng)基上培養(yǎng)后陸續(xù)可見白色小體胚，并逐漸長(zhǎng)大?！有w胚發(fā)生時(shí)間較‘紫娘喜早，且體胚數(shù)量大，正常體胚形態(tài)明顯。在體胚成熟初期，有些體胚體積逐漸增大，色澤乳白、鮮亮，個(gè)體飽滿；有些體胚則繼續(xù)增殖，產(chǎn)生一定數(shù)量次生胚；個(gè)別體胚漸長(zhǎng)出愈傷組織，或個(gè)別體胚干癟，底部變褐。將完全成熟的體胚轉(zhuǎn)接到萌發(fā)培養(yǎng)基后，由暗培養(yǎng)改為光照培養(yǎng)，體胚由乳白色逐漸轉(zhuǎn)綠，而后萌發(fā)成苗。正常的雙子葉胚經(jīng)約10 d的培養(yǎng)即開始抽莖展葉，形成具有根莖葉的完整植株。隨著體胚在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分體胚在胚芽處以交錯(cuò)方式分化出莖，逐漸形成一種多莖葉胚的彎曲花朵狀結(jié)構(gòu)；部分體胚2片子葉的發(fā)育不同步，導(dǎo)致僅形成單片葉子或者葉片肥厚且肉質(zhì)化；部分體胚分化出對(duì)稱生長(zhǎng)的葉片，葉片細(xì)長(zhǎng)、顏色深綠。大部分體胚抽莖后未展葉，有些表現(xiàn)為單莖未展葉，有些為多莖未展葉，該類胚經(jīng)培養(yǎng)可以部分展葉；另外有些體胚表現(xiàn)為芽點(diǎn)布滿整個(gè)胚的抽莖表面，經(jīng)進(jìn)一步培養(yǎng)可分化出莖（圖1-a～1-h）。

‘紫娘喜體胚多為形態(tài)不規(guī)則的近球狀胚，在成熟培養(yǎng)基上，成熟緩慢，大部分體胚不見膨大，而是反復(fù)產(chǎn)生一定數(shù)量且多為子葉形態(tài)分明的小次生胚，形成一個(gè)個(gè)不同步的體胚簇生體。此類次生胚子葉薄，與母體輕度相連，易脫落，將它們與母體分離或帶著母體切塊分離培養(yǎng)時(shí)，由于體胚過小，其生長(zhǎng)發(fā)育受到阻礙，常褐化死亡。體胚簇生體在光照下逐漸變綠，無抽莖萌發(fā)；或有個(gè)別體胚膨大，在光下延展出1～3條玻璃化綠色莖段，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也未見能展葉，相反，大部分體胚從底部開始變褐死亡（圖1-k～1-l）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)不同荔枝品種體胚成熟的影響

2.2.1 對(duì)‘妃子笑荔枝品種的影響

從表 1 中可看出，對(duì)于‘妃子笑荔枝品種而言，在C19培養(yǎng)基上其成熟的體胚萌發(fā)效果最佳，植株生長(zhǎng)健壯，顏色深綠，萌發(fā)率、展葉胚率均達(dá)最高，分別為59.6%與38.6%。體胚多為單莖胚，根系良好，多分根，生根率達(dá)62.1%，側(cè)根平均數(shù)目達(dá)3.2條/株（圖1-i～1-j）。

在C18培養(yǎng)基上成熟的體胚萌發(fā)率達(dá)49.3%，多莖胚率最高，為46.7%；生根率最大，為64.2%。在該成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)的體胚整體干燥，漸褐，多為無葉胚，體胚玻璃化率較高。

在C12與C14培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)率較高，分別為46.1%、44.8%；在這2種培養(yǎng)基上體胚展葉均較少，多為單莖無葉胚。C12體胚玻璃化最嚴(yán)重，達(dá)20.2%。C12與C14培養(yǎng)基上體胚生根率以及側(cè)根平均數(shù)目均較C18、C19的低。

在C16培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)率、展葉胚率與多莖胚率分別為34.6%、18.5%、26.9%，體胚玻璃化率為11.1%，主根平均長(zhǎng)度較短。

在C11、C13與C15培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)率相差不大，分別為29.6%、29.3%與28.9%，但其展葉情況不同，C11培養(yǎng)基上體胚無展葉，且3種培養(yǎng)基中其體胚玻璃化最嚴(yán)重，單莖胚居多；C13與C15培養(yǎng)基上體胚展葉胚率分別為7.9%、12.5%，C15多莖胚最少，多莖胚率為6.3%；C13莖段平均長(zhǎng)度最短；在C11、C13與C15 3種培養(yǎng)基上的體胚主根及分根明顯，其生根率依次為41.0%、50.0%與47.4%。

在C17培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)率最低，僅為26.9%，其體胚展葉也較少，展葉胚率僅為3.3%，體胚全無玻璃化，多為單莖胚。

2.2.2 對(duì)‘紫娘喜荔枝品種的影響

不同處理下‘紫娘喜體胚全無萌發(fā)。

2.3 不同濃度激素組合對(duì)不同荔枝品種體胚成熟的影響

從表2中的成苗率、單莖胚率與多莖胚率可以看出，單一的IAA或ABA激素對(duì)‘妃子笑體胚成熟及體胚出莖數(shù)目影響均不顯著，但I(xiàn)AA與ABA互作對(duì)體胚成熟及單莖胚或多莖胚的影響顯著。且當(dāng)ABA 濃度達(dá)1.0 mg/L及IAA 為0.5 mg/L時(shí)（C19）體胚萌發(fā)率、單莖胚率最高，分別為59.6%與73.0%；當(dāng)ABA 濃度為1.0 mg/L及IAA 為0.1 mg/L時(shí)（C18）多莖胚率最高，為46.7%（表1）。IAA及IAA與ABA互作對(duì)體胚展葉有極顯著影響，當(dāng)添加低濃度ABA時(shí)，體胚展葉胚率隨著IAA濃度的增加而增大，當(dāng)ABA濃度為1.0 mg/L、IAA濃度為0.5 mg/L時(shí)體胚展葉胚率最大，為38.6%。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABA、IAA與ABA互作對(duì)玻璃化苗胚及主根平均長(zhǎng)度影響不顯著，對(duì)體胚莖段平均數(shù)目有一定影響；ABA對(duì)側(cè)根平均數(shù)目及分根率有影響，IAA對(duì)體胚側(cè)根平均長(zhǎng)度、莖段平均長(zhǎng)度及生根率有影響。

綜上所述，‘妃子笑體胚最合適的成熟培養(yǎng)基是附加 0.5 mg/LIAA及 1.0 mg/L ABA的MS培養(yǎng)基。

不同激素組合處理下，‘紫娘喜體胚全無萌發(fā)，生根較少，稀有分根。

3 討論

體胚形態(tài)高度不同步化現(xiàn)象在其他植物體胚發(fā)生中均有存在，但是不同植物中又有其特殊性，如金花茶體胚發(fā)生過程中多芽體胚較常見[23]，蘋果離體葉片體胚發(fā)生過程中可見到單子葉胚、雙子葉胚、三子葉胚、杯狀胚、多子葉胚、畸形胚等各種形態(tài)胚[24]；爬山虎97%都為畸形胚，主要是連體胚、芽端畸形胚和超度含水狀胚[25]?；闻咴隗w胚發(fā)生過程中較為常見，但關(guān)于畸形胚產(chǎn)生的機(jī)理還缺乏深入的研究。一是認(rèn)為，與其染色體數(shù)目變異有關(guān)，但大部分研究認(rèn)為是與培養(yǎng)基中激素種類、質(zhì)量濃度有關(guān)，并且通過調(diào)節(jié)愈傷組織狀態(tài)、體胚發(fā)生及成熟培養(yǎng)基上的激素種類和濃度，能減少畸形胚的產(chǎn)生或使畸形胚萌發(fā)轉(zhuǎn)化為正常苗。Kong等[26]和黃學(xué)林等[27]認(rèn)為，ABA是針葉樹種體胚成熟的關(guān)鍵因子，其作用主要是促進(jìn)體胚成熟，防止裂生多胚及畸形胚的產(chǎn)生。對(duì)濕地松[28]、苜蓿[29]等的研究也表明，ABA是影響體胚產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素。胡玉玲等[30]研究指出，IAA對(duì)油茶體胚萌發(fā)影響最大。García-Martín等[31]研究表明，IAA與ABA在栓皮櫟體胚成熟及萌發(fā)中起重要作用；Feher等[32-33]研究也表明，IAA與ABA在不同植物體胚成熟及萌發(fā)中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加0.5 mg/L ABA時(shí)，‘妃子笑體胚成熟效果較佳，體胚萌發(fā)率為44.8%；當(dāng)另外添加0.5 mg/L IAA且ABA質(zhì)量濃度提高至1.0 mg/L時(shí)，體胚成熟效果最好，萌發(fā)率達(dá)59.6%，此時(shí)生根率也較大。但是不同濃度IAA與ABA組合對(duì)‘紫娘喜體胚成熟無明顯影響，‘紫娘喜次生胚及畸形胚還是較多。由此可見，‘妃子笑、‘紫娘喜體胚成熟所需IAA、ABA濃度組合有很大差異，因而不同品種胚性愈傷組織體胚成熟的適宜培養(yǎng)基還有待深入研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，體胚發(fā)生過程中衍生一種假珠芽的結(jié)構(gòu)，在一些子葉過度膨大的胚芽處及一些萌發(fā)的莖端處有類似結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。筆者認(rèn)為，假珠芽可能是芽發(fā)育受阻的單極胚，發(fā)育后期往往只見胚根伸長(zhǎng)或產(chǎn)生變態(tài)莖，其維管發(fā)育不好，沒有芽原基，但有表皮結(jié)構(gòu)和根原基。離體培養(yǎng)中出現(xiàn)的這種變態(tài)現(xiàn)象有待于進(jìn)一步探討。

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