鄧 浩，彭啟旺，李 偉

(武漢市紅十字會醫(yī)院普通外科，武漢 430021)

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見腫瘤，發(fā)病率逐年上升[1-3]。肝癌具有初期癥狀不明顯、潛伏期長的特點，多數(shù)患者確診時已是晚期，病情發(fā)展迅速，而且預(yù)后較差。目前，肝癌的主要治療方式是手術(shù)、肝移植、化療、分子靶向治療等，但治療效果均不理想，預(yù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡率居高不下的主要原因。近年來，通過免疫治療的方式逐漸應(yīng)用于臨床，其可通過刺激機體免疫系統(tǒng)靶向識別并特異性殺傷肝癌細(xì)胞，但對機體自身成分不具有危害性，而且可以產(chǎn)生免疫記憶細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)，因此免疫治療成為肝癌臨床治療的研究熱點和重點[4-5]。B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(B-lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)，又稱為PR結(jié)構(gòu)域蛋白1(positive regulatory domain zinc finger protein 1，PRDM1)，在B細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達量增加可促進細(xì)胞產(chǎn)生大量免疫因子，從而調(diào)控機體的免疫狀態(tài)[6-7]。近年來的研究表明，Blimp-1在腫瘤組織的表達量異常，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[8-9]。因此本實驗通過研究Blimp-1在肝癌細(xì)胞中的作用以及作用機制，為肝癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

肝癌SMMC-7721細(xì)胞系由本實驗室傳代、保存，最初購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自瑞士Roche公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Blimp-1單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自上海森雄生物有限公司；shRNA-NC、shRNA-Blimp1、空載體慢病毒由上海吉瑪生物公司合成。酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

肝癌SMMC-7721細(xì)胞置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含1%雙抗和10%胎牛血清)，倒置顯微鏡中觀察細(xì)胞生長狀況，隔天更換一次培養(yǎng)基，對數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，更換培養(yǎng)液，以每孔4 × 105個細(xì)胞接種于96孔板中。將細(xì)胞分為對照組、shRNA-NC組、shRNA-Blimp1(5’-GATCTGACCCGAATCAATG-3’)組，對照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞，shRNA-NC組和shRNA-Blimp1組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染攜帶無義序列和Blimp-1序列病毒(10 μL 1 × 1011TU/L)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中Blimp-1 mRNA的表達量

TRIzol法提取各組細(xì)胞中總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。根據(jù)Genebank中Blimp-1 mRNA的序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工合成，引物序列為：Blimp-1上游序列為5’-TGGACATGGAGGATGCGGATATG-3’，下游序列為5’-AGGTCCTTTCCTTTGGAGGAGTTG-3’；GAPDH上游序列為5’-GGGCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3’，下游序列為5’-GGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)置5個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計算基因相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中Blimp-1蛋白的表達量

收集各組細(xì)胞，BCA法定量、稀釋，100℃煮沸變性，吸取50 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，封閉液封閉1 h，分別加入一抗稀釋液，清洗，加入二抗孵育2 h，ECL顯色，曝光，顯影，與GAPDH灰度值的比值即為目的蛋白的相對量。

1.3.4 CCK-8檢測細(xì)胞的增殖

以每孔4 × 104個細(xì)胞接種于96孔板中，加入培養(yǎng)基至100 μL，放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)46 h，每孔加入5 μL CCK-8溶液，振蕩混勻，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm下細(xì)胞的吸光值(OD值)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡

收集各組1 × 106個細(xì)胞，采用annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，根據(jù)其說明書的指示進行下操作，置于流式細(xì)胞儀中計算細(xì)胞的凋亡率。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.3.6 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力

將已融化的Matrigel膠加入Transwell上室，37℃培養(yǎng)箱中干燥。收集各組細(xì)胞，調(diào)整為1 × 106/mL，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；PBS液清洗上室，擦去剩余細(xì)胞，酒精固定20 min，染色，100倍顯微鏡計數(shù)，取5個視野的平均值，實驗重復(fù)3次。

1.3.7 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IFN-γ、IL-2的表達量

收集各組培養(yǎng)72 h的細(xì)胞上清液，采用IFN-γ、IL-2 ELISA檢測試劑盒檢測IFN-γ、IL-2的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中Blimp-1的表達量

SMMC-7721細(xì)胞感染shRNA-NC、shRNA-Blimp1后，RT-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中Blimp-1的表達量，結(jié)果如表1、圖1所示，與對照組相比，shRNA-NC組細(xì)胞中Blimp-1 mRNA的表達量無明顯變化，shRNA-Blimp1組細(xì)胞中Blimp-1 mRNA的表達量較對照組顯著降低(P< 0.05)；Western blot結(jié)果同樣顯示，與對照組相比，shRNA-NC組細(xì)胞中Blimp-1蛋白水平無明顯變化，shRNA-Blimp1組細(xì)胞中Blimp-1蛋白水平顯著降低(P< 0.05)。

圖1 Western blot檢測各組細(xì)胞中Blimp-1蛋白的表達量Figure 1 Protein expression of Blimp-1 in each group of cells detected by Western blot

2.2 沉默Blimp-1對細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8法觀察各組細(xì)胞的增殖狀況，結(jié)果如表2所示，與對照組相比，shRNA-NC組細(xì)胞的增殖能力無明顯變化，shRNA-Blimp1組細(xì)胞的增殖能力顯著下降，差異有顯著性(P< 0.05)。

表1 各組細(xì)胞中Blimp-1的表達量Table 1 The expression of Blimp-1 in each group of cells

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表2 沉默Blimp-1對肝癌細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of silencing Blimp-1 on the proliferation of hepatoma cells

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

2.3 沉默Blimp-1對細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞的凋亡狀況，結(jié)果如表3、圖2所示，與對照組相比，shRNA-NC組細(xì)胞的凋亡率無明顯變化，shRNA-Blimp1組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.4 沉默Blimp-1對細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Transwell法分析各組細(xì)胞的侵襲能力變化，結(jié)果如表4所示，與對照組相比，shRNA-NC組細(xì)胞的侵襲數(shù)無明顯變化，shRNA-Blimp1組細(xì)胞的侵襲數(shù)顯著降低，差異有顯著性(P< 0.05)。

圖2 沉默Blimp-1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of silencing Blimp-1 on the apoptosis of hepatoma cells

組別Groups凋亡率Apoptosis rate對照組Control group4.215±0.563shRNA-NC組shRNA-NC group4.874±0.521shRNA-Blimp1組shRNA-Blimp1 group13.452±1.415*F值F-value92.258

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表4 沉默Blimp-1對細(xì)胞侵襲能力的影響Table 4 Effect of silencing Blimp-1 on cell invasion

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

2.5 沉默Blimp-1對細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IFN-γ、IL-2表達量的影響

采用ELISA法分析各組細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-2水平的變化，結(jié)果如表5所示，IL-2在各組間的變化差異不明顯；與對照組相比，shRNA-NC組IFN-γ蛋白水平無明顯變化，shRNA-Blimp1組IFN-γ蛋白水平顯著上調(diào)，差異有顯著性(P< 0.05)。

表5 沉默Blimp-1對細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IFN-γ、IL-2表達量的影響Table 5 Effect of silencing Blimp-1 on the expression of IFN-γ and IL-2 in cell culture supernatant

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

3 討論

Blimp-1最初被發(fā)現(xiàn)在大B細(xì)胞淋巴瘤中表達缺失，可能起抑制腫瘤發(fā)展的作用[10]。Blimp-1基因位于人常染色體上，具有7個外顯子，促進免疫B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的過程，抑制B細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達。研究表明，Blimp-1發(fā)生突變、轉(zhuǎn)錄翻譯異常等均可促進大B細(xì)胞淋巴瘤的產(chǎn)生，因此推斷Blimp-1基因可能具有抑癌基因的作用[11-12]。近年來的研究顯示，Blimp-1在腫瘤細(xì)胞的生長、分化、以及侵襲、遷移過程中發(fā)揮重要作用[13-15]。在肺癌中，采用免疫組織學(xué)的方法檢測Blimp-1在肺癌組織中的表達量，結(jié)果顯示，Blimp-1在鱗狀細(xì)胞肺癌中陽性表達率顯著增加，可作為臨床診斷的新的標(biāo)志物和研究治療靶點[16]。在喉癌組織中，Blimp-1的表達量顯著上調(diào)，并與患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Blimp-1基因可作為喉癌早期診斷以及預(yù)后判斷的重要靶基因[17]。

為探究Blimp-1在肝癌細(xì)胞中的作用，本文通過沉默Blimp-1在肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的表達量，RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，在shRNA-Blimp1組細(xì)胞中Blimp-1 mRNA和蛋白較對照組顯著降低；CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖和凋亡，結(jié)果顯示，與對照組相比，shRNA-Blimp1組細(xì)胞的增殖顯著降低，凋亡率顯著增加；Transwell小室法結(jié)果顯示，沉默Blimp-1基因顯著抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力，表明下調(diào)Blimp-1可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進其凋亡，抑制細(xì)胞的侵襲，從而抑制肝癌進一步的發(fā)展，在肝癌中發(fā)揮抑癌作用，與上述研究結(jié)果相一致。

研究發(fā)現(xiàn)，Blimp-1不僅對免疫細(xì)胞的終末分化以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有調(diào)控作用，而且對免疫因子的水平具有重要作用[18-20]。在免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和穩(wěn)定過程中，Blimp-1可與細(xì)胞因子IL-2相互作用從而發(fā)揮重要的作用[21]。在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中，IL-2的表達量具有重要意義[22]。IFN-γ是機體中重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其表達量的增加可以增強細(xì)胞的免疫原性，促進細(xì)胞凋亡。為了進一步探究Blimp-1在肝癌細(xì)胞中的作用，本研究通過ELISA檢測各組細(xì)胞中IL-2、IFN-γ的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Blimp-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞上清中IL-2的表達量無明顯影響，但可明顯增加IFN-γ的水平，提示Blimp-1可能通過促進IFN-γ的分泌從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，沉默Blimp-1促進IFN-γ的表達，顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進其凋亡，降低細(xì)胞的侵襲能力，從而阻礙肝癌的進一步惡化，為肝癌的臨床治療和診斷提供了實驗基礎(chǔ)。