胡龍江，周音頻△，曹運(yùn)蘭，呂 湛，藍(lán)運(yùn)競(jìng)，寧 琳，向立權(quán)，肖 鵬

(1.重慶市涪陵中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 408000；2.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550002；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川南充 637000)

隨著人民生活水平的不斷提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家及部分發(fā)展中國(guó)家。因此，進(jìn)一步明確心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找新的心血管疾病防治策略迫在眉睫。有研究表明，局部和全身炎癥反應(yīng)及自身免疫在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (NLRP3)炎性小體是一種包含NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白質(zhì)復(fù)合體,在機(jī)體正常免疫反應(yīng)過程中起重要作用，是炎癥-免疫的橋梁，在心血管疾病中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2-3]，它能促進(jìn)炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18的產(chǎn)生[4]，參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而當(dāng)IL-1β、IL-18作為炎性因子參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，機(jī)體抗炎因子如TGF-β亦會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。本研究通過檢測(cè)冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中NLRP3炎性小體的表達(dá)情況及血漿IL-1β、IL-18、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的水平變化，進(jìn)一步探討NLRP3炎性小體與冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年3-9月重慶市涪陵中心醫(yī)院健康體檢中心的健康體檢者30例(對(duì)照組)，心血管內(nèi)科收治的冠心病患者60例(冠心病組)，年齡均在40～80歲，對(duì)照組肝、心、腎、肺檢查均正常，排除自身免疫性疾病、代謝性疾病、急慢性感染性疾病、近期創(chuàng)傷、腫瘤、正在使用抗炎藥物者，排除有遺傳病及傳染病家族史者。冠心病組符合患冠心病診斷依據(jù)(行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)證實(shí))，排除移植血管病變者，排除嚴(yán)重心、肝、腎功能不全等慢性并發(fā)癥者，余排除標(biāo)準(zhǔn)同對(duì)照組。該研究獲重慶市涪陵中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1基本臨床資料采集 研究對(duì)象入組后，統(tǒng)計(jì)性別、年齡、吸煙史、平均動(dòng)脈壓(MAP)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、血脂等臨床資料，所有研究對(duì)象入組后次日06:00時(shí)抽取外周靜脈血20 mL，取4 mL全血離心，抽取血漿，置于-80 ℃冰箱中備用，剩余全血，注入肝素抗凝管，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度分離出PBMCs。

1.2.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA，測(cè)定其濃度并檢測(cè)純度。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列由TaKaRa公司合成，見表1。

1.2.3RT-qPCR反應(yīng) 應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件參照說明書，反應(yīng)結(jié)束后，作擴(kuò)增及溶解曲線，采用Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=(Ct病例組-CtGAPDH)-(Ct對(duì)照組-CtGAPDH)，病例組目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.2.4Western blot 按照Western blot及IP細(xì)胞裂解液提取PBMCs總蛋白，并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳，裁膜，轉(zhuǎn)膜，BSA-TBS封閉液封閉4 h，浸入含蛋白NLRP3(1∶100)、ASC(1∶1 000)，caspase-1(2.5 μg/mL)、內(nèi)參蛋白GAPDH(1∶500)的一抗稀釋液中，在 4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，在室溫孵育1 h，洗膜，凝膠成像分析系統(tǒng)顯影分析。

1.2.5ELISA檢測(cè) 應(yīng)用ELISA法測(cè)定血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平，嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1兩組基本資料及血脂、血糖水平比較 兩組性別、吸煙、年齡、BMI、FPG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MAP在冠心病組高于對(duì)照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)在對(duì)照組高于冠心病組(P<0.05)，見表2。

2.2兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 IL-1β、IL-18、TGF-β在冠心病組高于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

2.3兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較 PBMCs中ASC mRNA在冠心病組中的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

表1 引物序列

表2 兩組間基本情況及血脂、血糖水平變化比較

表3 兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖1兩組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA水平比較

2.4兩組NLRP3、ASC、caspase-1水平比較 PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1在冠心病組中的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2、3。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖2兩組NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平比較

圖3 兩組Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.5兩組NLRP3、ASC、caspase-1及其mRNA與其余各觀察指標(biāo)相關(guān)分析 對(duì)照組caspase-1 mRNA與FPG呈正相關(guān)(r=0.394，P=0.031)，NLRP3與性別呈正相關(guān)(r=0.429，P=0.020)，ASC與FPG呈正相關(guān)(r=0.405，P=0.026)，caspase-1與MAP、FPG呈正相關(guān)(r=0.447、0.396，P=0.013、0.030)；冠心病組，NLRP3 mRNA和caspase-1 mRNA均與IL-18呈正相關(guān)(r=0.327、0.274，P=0.011、0.031)，ASC與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關(guān)(r=0.370、0.467、0.403，P=0.024、0.009、0.027)；caspase-1與吸煙、IL-18呈正相關(guān)(r=0.613、0.414，P<0.01,P=0.023)。

2.6IL-1β、IL-18、TGF-β之間相關(guān)分析 Spearman相關(guān)分析顯示IL-1β、IL-18、TGF-β在對(duì)照組無相關(guān)性；而在冠心病組，IL-1β與TGF-β呈負(fù)相關(guān)(r=-0.287，P=0.026)。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性、漸進(jìn)性炎性疾病，炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及粥樣斑塊的破裂、繼發(fā)性血栓的形成過程中發(fā)揮著重要作用。在冠心病患者中，粥樣硬化斑塊是貫穿于冠心病的關(guān)鍵點(diǎn)。同樣，炎性反應(yīng)促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展及急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生。NLRP3炎性小體具有調(diào)控機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)的功能，NLRP3 是其最核心的組成部分，包括中間的核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域、C 端的亮氨酸重復(fù)序列及N 端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域，ASC是其銜接蛋白，與NLRP3 及caspase-1前體結(jié)合，并介導(dǎo)NLRP3激活caspase-1，而caspase-1 是其效應(yīng)蛋白，它被激活后促使促炎因子如IL-1β和L-18的前體轉(zhuǎn)化為活性形式[4-5]。

IL-1β 是經(jīng)典的炎性因子，參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的免疫與炎性反應(yīng)，在冠心病的發(fā)生發(fā)展及斑塊的破裂過程中起著重要作用[6]，其機(jī)制包括：促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移及增殖[7]；促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)沉積；促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成；上調(diào)CD40 及其配體的表達(dá)[8]；促進(jìn)免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)；促進(jìn)動(dòng)脈血栓形成。

IL-18是“多效能”炎性因子，在免疫及炎性反應(yīng)過程中扮演著重要角色，它不僅通過誘導(dǎo)INF-γ的生成；誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移及血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成；刺激血管壁細(xì)胞IL-1β、IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)；促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)及凋亡等機(jī)制促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展，而且增加動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性[9]，促進(jìn)易損斑塊的形成，參與易損斑塊的潰瘍、破裂、血栓的形成[10]。IL-18是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并可對(duì)冠心病患者病情的發(fā)展及嚴(yán)重冠脈事件作出預(yù)測(cè)[11-12]。

TGF-β是具有多種生物學(xué)功能的多肽生長(zhǎng)因子，在心血管系統(tǒng)中亦起重要作用。TGF-β具有抑制炎性反應(yīng)的作用，而在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中，TGF-β在機(jī)體過度表達(dá)，其通過多種途徑使其對(duì)機(jī)體有利的生物學(xué)作用降低[13]，反而通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增生、遷移、分化[14-15]；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與積聚，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[13-14]；誘導(dǎo)血管重構(gòu)[13-14]；促進(jìn)血栓形成[14]；增加纖維帽厚度等機(jī)制促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展。

本課題組通過檢測(cè)PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組PBMCs中ASC mRNA水平顯著低于冠心病組，提示NLRP3 炎性小體在患者病患者中部分組分在轉(zhuǎn)錄水平即表達(dá)增加，為冠心病患者激活NLRP3 炎性小體奠定了基本條件。雖然NLRP3 及caspase-1 mRNA的表達(dá)在冠心病患者中未見明顯增高，但均與IL-18呈正相關(guān)，提示NLRP3炎性小體在轉(zhuǎn)錄水平即有促進(jìn)炎性因子IL-18表達(dá)的傾向。本課題組進(jìn)一步提取PBMCs中總蛋白，并檢測(cè)NLRP3炎性小體各組分濃度，同時(shí)測(cè)定IL-1β、IL-18、TGF-β在血漿中的水平，發(fā)現(xiàn)冠心病患者中NLRP3、ASC、caspase-1濃度及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，提示PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；且ASC在冠心病組與年齡、IL-1β、IL-18呈正相關(guān)，caspase-1在冠心病組與吸煙、IL-18呈正相關(guān)，IL-1β在冠心病組與TGF-β呈負(fù)相關(guān)，提示在冠心病患者中，發(fā)揮正常免疫功能的NLRP3 炎性小體的調(diào)控失去平衡性，它被激活后，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β 、IL-18 過量生成，繼而通過下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生炎性瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈炎性損傷。但在冠心病患者中，促炎因子IL-1β 和IL-18的表達(dá)并未直接促進(jìn)抗炎因子TGF-β的表達(dá)，冠心病患者血漿TGF-β的高表達(dá)，與其他途徑密切相關(guān)，本課題組將進(jìn)一步研究。

綜上所述，PBMCs中NLRP3炎性小體以及血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18信號(hào)通路可能在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但該通路并未促進(jìn)冠心病患者抗炎因子TGF-β的表達(dá)，血漿TGF-β高表達(dá)可能與其他途徑密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步研究NLRP3-ASC-caspase-1- IL-1β/IL-18信號(hào)通路以及TGF-β的激活及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而針對(duì)該通路及TGF-β的干預(yù)有可能成為防治冠心病潛在而有效的策略。