韓虎魁，李剛，李其勇，陳勇，田文杰，李進嵩，黃浩，陶劍虹

方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測我院收治的90例CHF患者（CHF組）及40例健康體檢者（對照組）血漿LncRNA XIST的表達，分析血漿LncRNA XIST表達水平與B型利鈉肽（BNP）、左心室射血分數等臨床參數之間的相關性；用受試者工作特征曲線分析LncRNA XIST對CHF的預測作用；用Kaplan Meier生存分析LncRNA XIST對CHF患者1年生存率的影響；用多因素COX回歸分析影響CHF患者預后的因素。

結果：與對照組比較，LncRNA XIST在CHF組患者中的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。血漿LncRNA XIST的表達與BNP水平呈正相關（r=0.685，P=0.001），與左心室射血分數呈負相關（r=-0.618，P=0.002）。血漿LncRNA XIST診斷CHF的效率為0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。LncRNA XIST高表達患者的1年平均生存時間短于LncRNA XIST低表達者[（5.38±1.22）個月 vs（10.35±1.98）個月]，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=37.98，P＜0.001）。多因素COX回歸分析顯示，LncRNA XIST高表達是CHF患者預后的獨立影響因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

結論：血漿LncRNA XIST高表達與CHF有一定的相關性，高表達LncRNA XIST與CHF患者的預后較差有關。

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年上升，正日益威脅著人們的身體健康[1]。早期正確診斷和狀態(tài)評價有助于采用合理治療并降低心力衰竭（HF）患者的死亡率，但目前缺乏有效的早期診斷及預后評估生物標志物[2]。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類內長度超過200 nt的功能性RNA，位于細胞核內或胞漿，在真核細胞內被普遍轉錄，但不具有或很少有蛋白編碼功能[3]。近年來的研究表明，LncRNA參與人類許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，如癌癥、HELLP綜合征和短指綜合征。然而，LncRNA在HF患者中的研究報道較少[4-6]。前期通過基因芯片發(fā)現，LncRNA X染色體失活特異性轉錄本基因（X-inactive specific transcript，XIST）在CHF患者血漿中的表達明顯高于正常對照組，提示LncRNA XIST可能參與和調節(jié)CHF的發(fā)生、發(fā)展。本研究旨在研究LncRNA XIST在CHF患者血漿中的表達及對預后的影響。

1 資料與方法

研究對象：入選2014-01至2017-01在我院心血管內科經臨床確診的CHF患者90例為CHF組。入選標準：（1）符合CHF診斷標準或有左心室擴大、左心室射血分數降低；（2）有明確導致HF的基礎疾??；（3）年齡＞18歲，性別不限；（4）正規(guī)抗HF治療不少于1個月。排除標準：（1）惡性腫瘤性疾病或嚴重感染性疾病、器官移植病史、急性失代償性HF；（2）入選前1個月內發(fā)生急性冠狀動脈事件（不穩(wěn)定性心絞痛、急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死）；（3）血肌酐 ＞2.5 mg/ml；（4）已有文獻報道的會對循環(huán)LncRNA XIST水平造成影響的情況。另選擇健康對照受試者40例為對照組。對照組經詳細問診、查體及實驗室檢查，排除器質性心臟疾病及其他系統(tǒng)的急、慢性疾病和已知會對LncRNA XIST表達造成影響的疾?。恍碾妶D無異常，超聲心動圖排除心臟結構和心功能異常。所有研究者均簽署知情同意書, 經我院倫理委員會批準。

一般實驗室檢查：兩組受試者在入院時接受血漿B型利鈉肽（BNP）以及肝、腎功能等相關指標檢測。

血漿總RNA提取：兩組受試者均采集清晨空腹肘靜脈血5 ml，即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3000 rpm離心15 min，留取上層血漿，置于-80℃冰箱備用。將分離所得血漿，置于冰上融化；取250 μl血漿樣品，加入750 μl Trizol（RNA抽提試劑），振蕩器混勻，靜置5 min；加入200 μl氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下離心12 000 rpm、10 min，留取上清液并量取其體積，轉移至另一個無 核糖核酸酶（Rnase）的EP管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下離心12 000 rpm、10 min；倒出管內液體，加用1 ml 75%乙醇；室溫12 000 rpm離心2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入10 μl無Rnase的雙蒸水（ddH2O），以能夠充分溶解RNA；用分光光度計測定總RNA濃度及純度。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析LNCRNA XIST的表達水平：提取血漿總RNA，逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μl體系中加2 μg總RNA進行互補脫氧核糖核酸（cDNA）的合成。qRT-PCR采用2x SYBR Green PCR Master Mix試劑，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μl體系進行擴增，每個待測樣本設置3個平行樣，根據目標基因設計合成相應上下游引物進行PCR擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參照。PCR反應在定量PCR反應儀上進行。三次獨立實驗后得到的數據運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。血液標本中LncRNA XIST的表達差異采用t檢驗分析，用 ±s表示；血漿LncRNA XIST與BNP水平的相關性分析采用線性回歸法；用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿LncRNA XIST表達水平對CHF的預測能力；用Kaplan-Meier法分析血漿LncRNA XIST表達水平與患者1年生存時間的關系；用多因素COX回歸分析CHF患者預后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組受試者的一般資料比較（表1）：CHF組90例患者平均年齡（60.35±13.39）歲，其中男性48例，女性42例；紐約心臟協(xié)會心功能分級Ⅰ級20例，Ⅱ級23例，Ⅲ級22例，Ⅳ級25例。對照組40例受試者平均年齡（58.95±7.65）歲，其中男性22例，女性18例。兩組受試者在性別、年齡、身高、體重、血門冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶水平、吸煙和高尿酸血癥者比例等方面的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

表1 兩組受試者的一般資料比較

表1 兩組受試者的一般資料比較

注：CHF：慢性心力衰竭；AST：門冬氨酸氨基轉移酶；ALT：丙氨酸氨基轉移酶

項目 CHF組(n=90) 對照組(n=40) P值性別(男/女，例) 48/42 22/18 0.860年齡(歲) 60.35±13.39 58.95±7.65 0.170身高(cm) 160.0±15.0 159.0±15.0 0.712體重(kg) 60.0±12.0 57.0±10.0 0.545吸煙[例(%)] 50(55.6) 29(72.5) 0.068 AST(mmol/L) 46.0±13.0 40.0±10.0 0.090 ALT(mmol/L) 49.8±11.0 45.5±13.4 0.099高尿酸血癥[例(%)] 50(55.6) 26(65.0) 0.313

兩組受試者血漿中LNCRNA XIST與BNP水平比較（圖1）：與對照組比較，CHF組患者的血漿LncRNA XIST及BNP水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（t分別為12.69和14.63，P均＜0.001）。

圖1 兩組受試者血漿LncRNA XIST（1A）與B型利鈉肽水平（1B）比較

CHF患者血漿LncRNA XIST與BNP水平的相關性分析（圖2）：線性相關分析顯示，CHF患者血漿LncRNA XIST與BNP水平呈正相關關系（r=0.685，P=0.001）， 與 LVEF呈 負 相 關 關 系（r=-0.618，P=0.002）。

圖2 血漿LncRNA XIST與B型利鈉肽水平（2A）及左心室射血分數（2B） 的關系

血漿LncRNA XIST水平預測CHF的ROC曲線分析結果（圖3）：ROC曲線分析顯示，作為預測CHF的生物標志物，血漿LncRNA XIST水平的曲線下面積（AUC）為 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。

圖3 血漿LncRNA XIST水平預測慢性心力衰竭的受試者工作特征曲線

Kaplan-Meier法分析血漿LncRNA XIST表達水平與CHF患者1年生存時間的關系（圖4）：根據血漿LncRNA XIST平均表達水平，90例CHF患者中，44例LncRNA XIST高表達（≥8.939），其余46例LncRNA XIST低表達（＜8.939）。Kaplan-Meier分析顯示，LncRNA XIST高表達患者的1年平均生存時間[（5.38±1.22）個月]短于低表達者[（10.35±1.98）個月]，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=37.98，P＜0.001）。

圖4 血漿LncRNA XIST表達水平與慢性心力衰竭患者1年生存時間的關系

多因素COX回歸分析CHF患者預后的影響因素（表2）：分析結果顯示，LncRNA XIST高表達是CHF患者預后的獨立影響因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

表2 多因素COX回歸分析慢性心力衰竭患者預后的影響因素

3 討論

HF是指心臟不能維持足夠的心輸出量以滿足身體對代謝的需要和靜脈血回流受阻的狀態(tài)[7]，是許多心血管疾病終末期的表現。研究表明，人群中HF的患病率和發(fā)病率隨著年齡增加而大幅度升高，50歲人群中HF的患病率為1%，80歲年齡段可升至10%，HF的年發(fā)病率在45～54歲人群中為0.2%，而在85～94歲年齡段則為4%[8,9]。我國2000年大樣本調查結果表明，HF發(fā)病率為0.9%，隨著年齡增高，HF的發(fā)病率顯著上升[10,11]。HF患者預后差，死亡率高，其具體的發(fā)病機制及預后預測標志物尚未完全闡明[12,13]。

LncRNA是一類位于細胞核內或胞漿內長度超過200 nt的功能性RNA，在真核細胞內被普遍轉錄，但不具有或很少具有蛋白編碼功能。近年來，LncRNA與復雜疾病發(fā)生之間的關系備受關注，人們對LncRNA在細胞生物學中的功能模式展開了一系列研究。最近研究表明，LncRNA的異常表達與心血管疾病的發(fā)生密切相關[14,15]。Wang等[16]的研究發(fā)現，抑制重組人抗增殖蛋白2（PHB2）的失活，可抑制心肌細胞凋亡。Wang等[17]為探討心肌肥大細胞中微小RNA（miR）和LncRNA的作用，使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）對體外培養(yǎng)的心肌細胞進行干預，發(fā)現心肌細胞中miR-489表達量明顯減少。使用基因轉染技術上調心肌細胞中miR-489的表達量可拮抗Ang Ⅱ導致的細胞肥大損傷；進一步探索其中的分子機制時發(fā)現，LncRNA CHRF可作為miR-489的“內源性海綿”，下調miR-489的表達水平，從而對miR-489的靶基因Myd88進行調控，影響心肌細胞肥大。Leung等[18]為研究AngⅡ對基因轉錄網絡的影響，使用AngⅡ干預體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞，發(fā)現參與細胞增殖的miR-221和miR-222轉錄自LncRNA Ang362，敲除Ang362后miR-221和miR-222表達下降，血管平滑肌細胞增殖降低。

LncRNA XIST是哺乳動物體內X染色體失活的主要調節(jié)基因，并且XIST基因只能從失活的X染色體中轉錄而來[19]。多項研究證實，XIST在人類細胞分化、增殖和基因組功能與形態(tài)的維護方面發(fā)揮重要作用[20-22]。但目前國內外尚未見LncRNA XIST在心血管疾病中的作用及機制的相關報道。本研究發(fā)現，與健康對照者比較，LncRNA XIST在CHF患者中的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；血漿LncRNA XIST的表達與BNP水平呈正相關（r=0.685，P=0.001），與左心室射血分數呈負相關（r=-0.618，P=0.002）；血漿LncRNA XIST水平預測 CHF 的效率為 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）；高表達LncRNA XIST患者的1年平均生存時間明顯短于LncRNA XIST低表達者（P＜0.05）。

總之，本研究提示，血漿LncRNA XIST高表達與CHF有一定的相關性，高表達LncRNA XIST與CHF患者的預后差相關。