羅 霞 胡 彬 王欣玲 秦桂芳 吳勝英

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等途徑分泌血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）等。ET-1和NO在抑制血管壁炎癥反應(yīng)及平滑肌細(xì)胞增殖、抗血栓形成、調(diào)節(jié)血管緊張性等方面發(fā)揮著重要作用［1］。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的舒血管因子，L-精氨酸在NO合酶 （eNOs）作用和催化下產(chǎn)生NO，后者通過激活鳥氨酸環(huán)化酶，介導(dǎo)cGMP而發(fā)揮調(diào)控血管舒張功能［2］。不僅如此，NO還具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖、血小板聚集及單核細(xì)胞黏附性等重要功能［3］。然而在缺血再灌注等有害因素作用下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒血管因子NO減少，縮血管因子ET-1增多，造成血管平衡穩(wěn)態(tài)失衡，血管內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂［4］。除上述血管活性物質(zhì)外，缺血再灌注后還會(huì)引起白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等多因素參與缺血再灌注后血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)［5］。臨床收治的急性腦梗死患者在經(jīng)溶栓治療后，由于血流再通，常出現(xiàn)缺血再灌注后損傷而加重臨床癥狀，患者因急性腦功能缺損而致殘甚至死亡。中藥制劑丹紅注射液在抑制缺血再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)血管新生等方面有一定的作用，但針對(duì)缺血再灌注后損傷造成的血管內(nèi)皮炎癥性損傷的相關(guān)研究還不夠系統(tǒng)［6］。本研究采用線栓大腦中動(dòng)脈willis環(huán)缺血45 min后再灌注的方法模擬人急性腦梗死后缺血再灌注后損傷，并用丹紅注射液進(jìn)行治療，分析其干預(yù)機(jī)制，為臨床治療急性腦梗死提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠共72只，體質(zhì)量（180±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心，許可證：SCXK（鄂）2017-0008。動(dòng)物房12 h交替光照，22℃恒溫，濕度控制在70%～80%，動(dòng)物自由飲水，分籠、普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 丹紅注射液（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：16061034）；麻醉用水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)：20170119）；奈必洛爾（杭州甫洛生物科技有限公司，批號(hào)：152520-56-4）；鼠抗FLK-1、VEGF及eNOs檢測(cè)用ELISA試劑盒 （上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：2017360323，20170412，218360343）；NO試劑盒 （上海勁馬生物科技有限公司， 批號(hào)：20170743）；NF-κB 和 AP-1激活－核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒 （北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：2180124，201711294）；ICAM-1、VCAM-1 和 ET-1 檢測(cè)用ELISA試劑盒 （上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)：XFR31370，XFR31374）；FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司）］；752N紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析/上海精科）。

1.3 造模及分組 實(shí)驗(yàn)前將直徑為0.22 mm的尼龍釣魚線消毒剪成4 cm長，將一端用細(xì)沙布打磨平滑，然后消毒備用。配制10%水合氯醛備用。將丹紅注射液和奈必洛爾均配制成0.1%溶液備用。選取60只體質(zhì)量相近的SD大鼠進(jìn)行線栓大腦中動(dòng)脈willis環(huán)缺血45 min后再灌注手術(shù)，造模參考文獻(xiàn)［7］執(zhí)行，術(shù)前動(dòng)物禁食禁水12 h，稱質(zhì)量后腹腔注射水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉，待大鼠麻醉后固定，用電動(dòng)剃須刀清理頸胸部鼠毛，碘伏消毒，切開皮膚，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，延頸內(nèi)動(dòng)脈分離進(jìn)入顱內(nèi)的翼腭動(dòng)脈并分別夾閉。然后用眼科剪將左側(cè)頸總動(dòng)脈剪一V形口，將備用的栓線緩慢插入，插入深度約18 mm，或有阻力感為即止，待尼龍栓線進(jìn)入willis環(huán)后，阻斷willis環(huán)供血45 min，然后將絲線抽出約10 mm，使willis血液再通。剪去突出在皮膚上的尼龍栓線，使部分尼龍栓線保留在左側(cè)頸總動(dòng)脈中以防止出血，然后縫合創(chuàng)口并消毒。成模標(biāo)準(zhǔn)以大鼠行為學(xué)改變?yōu)闇?zhǔn)：1）12 h后大鼠出現(xiàn)左前爪內(nèi)收，動(dòng)物行走時(shí)向左側(cè)偏轉(zhuǎn)。2）將大鼠提起，出現(xiàn)左前爪內(nèi)收或不能伸展，動(dòng)物因此出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)或轉(zhuǎn)圈。術(shù)后挑選造模成功的36只大鼠隨機(jī)均分為模型組、奈必洛爾組和丹紅組，每組12只，另12只未手術(shù)的SD大鼠設(shè)為對(duì)照組作為對(duì)照，對(duì)照組手術(shù)步驟同上，但在分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈后不插入栓線造模。

1.4 干預(yù)方法 治療前先將丹紅注射液和奈必洛爾配制成0.1%的溶液備用，治療前根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥換算公式，計(jì)算丹紅注射液和奈必洛爾的用藥量分別是 5 mg/（kg·d）和 2.5 mg/（kg·d）。 模型組和對(duì)照組每只大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL。奈必洛爾組每只大鼠尾靜脈注射β1受體阻滯劑奈必洛爾0.2 mL。丹紅組每只大鼠尾靜脈注射丹紅注射液0.2 mL。4組均治療14 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 治療結(jié)束后先采眶靜脈血，再處死動(dòng)物取willis動(dòng)脈環(huán)編號(hào)后凍存。采用硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO含量（用752N紫外可見分光光度計(jì)讀取所測(cè)值）；雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）檢測(cè)血清ICAM-1含量：檢測(cè)時(shí)取眶靜脈血0.1 mL，4℃過夜后，1000g離心15 min，取上清檢測(cè)。加樣前先設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品樣品稀釋液100 μL，其它分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，37℃孵育90 min。倒去孔內(nèi)液體，加入100 μL生物素抗體工作液，37℃孵育60 min。洗滌3次，加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min。洗滌5次，加入50 μL底物溶液，37℃孵育 15 min。 加入 50 μL終止液，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測(cè)量ICAM-1的OD值。然后以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品的相應(yīng)的實(shí)際濃度。NF-κB、AP-1、VCAM-1、IL-10 和 ET-1 參考以上方法嚴(yán)格按檢測(cè)說明操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。先進(jìn)行方差分析，對(duì)于方差齊、正態(tài)分布的組間比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)組間比較采用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié) 果

2.1 各組 NF-κB、AP-1、ICAM-1和 VCAM-1水平比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組靜脈血NF-κB、AP-1、ICAM-1、VCAM-1 和 ET-1 含量均升高 （P＜0.05）。奈必洛爾組 NF-κB、AP-1、ICAM-1、VCAM-1 與模型組比較均有一定程度降低（P＜0.05）。與模型組和奈必洛爾組比較，丹紅組 NF-κB、AP-1、ICAM-1、VCAM-1均明顯降低（P＜0.05）。

表 1 各組 NF-κB、AP-1、ICAM-1 和 VCAM-1 水平比較（±s）

表 1 各組 NF-κB、AP-1、ICAM-1 和 VCAM-1 水平比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與奈必洛爾組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n NF-κB（ng/mL） AP-1（pg/mL）ICAM-1（ng/mL）VCAM-1（pg/mL）對(duì)照組 12模型組 12奈必洛爾組 12 4.97±0.24 2.14±0.13 36.01±2.51 17.80±2.29 6.69±0.47* 3.64±0.22* 44.20±5.03* 26.34±1.53*5.10±0.33*△ 3.02±0.10*△ 39.25±2.97*△ 22.37±2.54*△丹紅組 124.76±0.36△▲ 2.35±0.07△▲ 37.14±4.05△▲ 19.30±1.94△▲

2.2 各組NO、eNOs、ET-1及 IL-10水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組NO、eNOs和IL-10均降低，ET-1升高（P＜0.05）。奈必洛爾組NO、eNOs均顯著升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），但ET-1和IL-10與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。丹紅組與模型組比較，NO、eNOs和IL-10均顯著升高（P＜0.05）。但丹紅組NO、eNOs與奈必洛爾組比較，無明顯差異（P＞0.05），而ET-1降低程度和IL-10升高程度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 2 各組 NO、eNOs、ET-1 及 IL-10 水平比較（±s）

表 2 各組 NO、eNOs、ET-1 及 IL-10 水平比較（±s）

組 別 n NO（ng/mL） eNOs（pg/mL） ET-1（ng/L） IL-10（pg/mL）對(duì)照組 12模型組 12奈必洛爾組 12 11.35±1.63 7.28±0.94 21.07±1.03 16.28±3.07 8.02±0.74* 6.27±0.53* 27.21±2.14* 14.33±1.85*19.56±2.35*△ 10.86±1.03*△ 26.58±2.74* 15.02±4.27*丹紅組 1218.28±2.32△ 9.69±0.91△ 20.85±1.82△▲ 24.39±3.11△▲

3 討 論

臨床收治的急性腦梗死患者其起病急驟，且在溶栓治療后常因血液再通而引起嚴(yán)重的腦缺血-再灌注損傷，而缺血-再灌注后的氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，這一反應(yīng)會(huì)通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎癥細(xì)胞的生長和遷移并激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB，促進(jìn)黏附分子ICAM-1，VCAM-1及ET-1過表達(dá)而引起血管內(nèi)皮損傷［8］。急性腦梗死患者患者常因以上級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使該病病死率和致殘率居高不下，故如何消除“氧化應(yīng)激”反應(yīng)，降低腦缺血-再灌注后血管內(nèi)皮損傷對(duì)提高臨床療效具有重要意義。

丹紅注射液提取自中藥丹參和紅花，其中丹參味辛，性涼，主治心腦腹痛，而《藥品化義》記載紅花“味辛性溫”，善通利經(jīng)脈，因其具有“活血、化瘀、通經(jīng)、祛瘀、止痛”之功，現(xiàn)臨床上常用于防治心腦血管系統(tǒng)疾?。?-10］。

在本研究中，陽性藥組（奈必洛爾組）尾靜脈注射β1受體阻滯劑奈必洛爾，作為高選擇性的β1腎上腺素受體阻滯劑，奈必洛爾可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOs釋放NO，從而增加血流介導(dǎo)的血管舒張功能，達(dá)到降低外周血管阻力和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的目的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹紅組NO、eNOs均顯著升高，且與奈必洛爾組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示丹紅注射液有與陽性藥奈必洛爾相同的藥理作用，可通過提高內(nèi)皮細(xì)胞eNOs活性，促進(jìn)NO釋放而產(chǎn)生保護(hù)損傷內(nèi)皮的作用，與鄧芬等研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液可提高大鼠局灶腦缺血后eNOs含量一致［11］。腦缺血-再灌注后炎癥反應(yīng)是腦組織損傷的重要機(jī)制，而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的激活在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［12］。ICAM-1、VCAM-1和ET-1也參與炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向血管內(nèi)皮黏附，而這會(huì)造成白細(xì)胞向炎癥區(qū)移行，使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞牢固黏附，造成腦組織微血管阻塞，使炎癥反應(yīng)加重。ET-1是血管活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子之一，具有強(qiáng)效的調(diào)節(jié)血管收縮作用，其參與新生血管生成和血管重塑，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，尤其在血栓性疾病的病理改變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［13］。對(duì)心腦血管疾病的預(yù)后具有重要意義，高水平ET-1常預(yù)示發(fā)生血栓性疾病的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)高于ET-1正常人群［14］。因此，調(diào)控或抑制腦缺血-再灌注時(shí)VCAM-1、ICAM-1和 ET-1的表達(dá)可減輕腦缺血時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低腦缺血-再灌注損傷的程度。實(shí)驗(yàn)還觀察到丹紅組靜脈血NF-κB、AP-1、ICAM-1、VCAM-1 和 ET-1 均明顯降低 （P＜0.05）。提示丹紅注射液通過抑制缺血-再灌注后NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎性細(xì)胞因子及VCAM-1和ICAM-1的生成，從而減輕腦缺血-再灌注后腦組織繼發(fā)性炎癥反應(yīng)引起的血管內(nèi)皮損傷，從而發(fā)揮對(duì)腦組織腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用［15-16］。研究表明，炎癥反應(yīng)也是腦缺血-再灌注損傷的重要機(jī)制之一，IL-10來源于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th2，具有抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答、抑制巨噬細(xì)胞的抗原提呈和合成細(xì)胞因子等功能，可促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖及抗體產(chǎn)生，是機(jī)體重要的抗炎細(xì)胞因子，在腦缺血后發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用［17］。有學(xué)者［18］發(fā)現(xiàn)IL-10基因敲除小鼠腦梗死24 h后腦梗死面積和質(zhì)量均較正常腦缺血-再灌注小鼠高，且在體外模型中，IL-10基因敲除小鼠與來源于野生型小鼠的神經(jīng)元原代細(xì)胞對(duì)氧-糖剝奪及興奮性毒性更加敏感；由此得出，不論是外源性IL-10，還是內(nèi)源性IL-10，在腦缺血-再灌注時(shí)均具有神經(jīng)保護(hù)作用［19-20］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹紅注射液可提高內(nèi)源性IL-10，這可能是丹紅注射液保護(hù)腦缺血-再灌注損傷的重要機(jī)制之一。以上諸多觀察結(jié)果證實(shí)丹紅注射液在治療急性腦梗死時(shí)的神經(jīng)保護(hù)功能方面雖無β1受體阻滯劑奈必洛爾強(qiáng)，但可通過多機(jī)制發(fā)揮缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，丹紅注射液有與β1受體阻滯劑奈必洛爾相同的腦血管內(nèi)皮損傷保護(hù)作用，但其除可提高內(nèi)皮細(xì)胞eNOs及靜脈血NO含量而保護(hù)損傷內(nèi)皮外，還可通過提高內(nèi)源性IL-10表達(dá)，降低VCAM-1和ICAM-1的生成，抑制缺血再灌注后氧化應(yīng)激造成的血管內(nèi)皮炎癥性損傷，從而改善血管內(nèi)皮功能紊亂現(xiàn)象。