王輝俊 柯櫻 葉冠

摘 要 目的：建立瓜蔞皮注射液中腺苷和唾液酸的HPLC-MS/MS定量分析方法。方法：采用Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，3.5 mm），流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式監(jiān)測，源噴射電壓：-4.500 kV；霧化溫度：550 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對瓜蔞皮注射液中腺苷和唾液酸進(jìn)行定量分析。結(jié)果：腺苷和唾液酸線性關(guān)系均良好（R≥0.995），線性范圍均為250～32 000 nmol/L，腺苷和唾液酸的檢出限分別為31.25 nmol/L和3.91 nmol/L。應(yīng)用建立的HPLC-MS/MS方法測定了3批瓜蔞皮注射液中腺苷和唾液酸的含量，分別為1.407～1.465 mmol/L和251.0～678.7 nmol/L。結(jié)論：該方法靈敏性、專屬性和選擇性好，可用于瓜蔞皮注射液中腺苷和唾液酸的定量測定和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 瓜蔞皮注射液 HPLC-MS/MS 腺苷 唾液酸

中圖分類號：TQ460.72； R286 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）17-0072-04

Determination of the contents of adenosine and N-acetylneuraminic acid in Gualoupi injection by HPLC-MS/MS*

WANG Huijun**， KE Ying， YE Guan***

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai， 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC-MS/MS method for the determination of adenosine and N-acetylneuraminic acid （NANA） in Gualoupi injection. Method： HPLC analysis was performed on a column of Waters Xbridge C18 （4.6 mm×50 mm， 3.5 mm） with linear gradient elution of methanol-0.1% formic acid solution. Mass spectrometry analysis was carried out at ion spray voltage of ？4.500 kV and the turbo spray temperature of 550 ℃ with electrospray ionization （ESI） ion source in negative mode. The contents of adenosine and NANA in Gualoupi injection were quantitatively determined by multiple reaction monitoring （MRM）. Results： The standard curves of both adenosine and NANA showed good linearity （R≥0.995） over the range of 250-32 000 nmol/L and their detective limits were 31.25 nmol/L and 3.91 nmol/L. The contents of adenosine and NANA determined by HPLC-MS/MS in three batches of Gualoupi injections were 1.407-1.465 mmol/L and 251.0-678.7 nmol/L， respectively. Conclusion： This method possesses good sensitivity， specification and selectivity and can be used for the determination and quality control of adenosine and NANA in Gualoupi injection.

KEy WORDS Gualoupi injection； HPLC-MS/MS； adenosine； N-acetylneuraminic acid

瓜蔞皮注射液為上藥集團(tuán)子公司上海第一生化藥業(yè)有限公司獨(dú)家產(chǎn)品，是以瓜蔞皮為原料，經(jīng)水提醇沉，再經(jīng)過離子交換樹脂洗脫而制成的滅菌水溶液，收載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科-心系分冊438頁（WS-11417（ZD-1417）-2002-2008）。臨床上用于冠心病、穩(wěn)定性心絞痛的治療，具有行氣除滿、開胸除痹之功效[1-5]。瓜蔞皮注射液臨床應(yīng)用廣泛，但目前僅測定與功能主治無關(guān)的精氨酸作為含量測定標(biāo)準(zhǔn)。我們前期已做了大量瓜蔞皮注射液物質(zhì)基礎(chǔ)的工作，鑒定出7個氨基酸、4個核苷酸、5個黃酮、1個多肽、1個唾液酸、1個含氮化合物和2個低分子量聚糖[6-8]，其中腺苷具有治療室上心肌過速，動脈粥樣硬化，急性心肌梗死、心肌保護(hù)和突發(fā)性耳聾等作用[9-12]。有報道證明唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸，簡稱NANA）能夠降低血液高凝血狀態(tài)，從而預(yù)防和阻止凝血相關(guān)的心血管疾病發(fā)生[13]。本研究通過HPLC-MS/MS對瓜蔞皮注射液中的腺苷和唾液酸進(jìn)行含量測定，為瓜蔞皮注射液的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

瓜蔞皮注射液（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司上海第一生化藥業(yè)有限公司提供，4 ml/支，批號為1707201，1707202，1707203），對照品腺苷（純度99.5%，貨號A108808-5 g）和唾液酸（純度98%，貨號A100555-100 mg）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；HPLC級甲醇購自德國Merck公司；甲酸（FA）為色譜純，購自美國Fluka公司；其它的試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

島津CBM20A系列高效液相色譜儀（包括自動進(jìn)樣器、輸液泵、柱溫箱、脫氣機(jī)等）（日本島津公司）配API 4000 MDTM MS/MS系列三重四級桿質(zhì)譜儀、Turbo Spray離子源和Analyst 1.6.1 software數(shù)據(jù)系統(tǒng)（均為美國AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，3.5 mm）；柱溫：35 ℃；流速：0.6 ml/min；進(jìn)樣量：5 ml；以0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～3.5 min，2%～95% B；3.5～4.5 min，95% B；4.5～4.6 min，95%～2% B；4.6～5.5 min，2% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，定量分析采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）；源噴射電壓（IS）：-4.500 kV；霧化溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GS1）：60 psi；輔助氣（GS2）：40 psi；氣簾氣（CUR）：20 psi；碰撞氣（CAD）：6 psi；接口加熱，全程通入氮?dú)?，腺苷和唾液酸解簇電壓（DP）分別為-30 V和-35 V和碰撞能量（CE）分別為-26 eV和-22 eV，監(jiān)測離子對分別為266.1/133.8和308.2/87.1。對照品和供試品的提取離子流圖見圖1。

1.3.3 溶液的制備

1）供試品溶液 取瓜蔞皮注射液3批，每批3瓶。每瓶樣品取2 ml，用0.22 mm微孔濾膜濾過備用，用于唾液酸含量測定；另取樣品20 ml加入1 980 ml超純水渦旋混勻，并用0.22 mm微孔濾膜濾過備用，用于腺苷含量測定。

2）混合對照品溶液 分別取腺苷和唾液酸對照品適量，精密稱定，加超純水制成對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量，加超純水制成0.1 mmol/L的混合對照品溶液，備用。

1.3.4 線性關(guān)系考察

將混合對照品溶液進(jìn)一步稀釋成0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.0、32.0 μmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，分別測定峰面積。分別以腺苷和唾液酸對照品的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，峰面積/1 000為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.3.5 選擇性和檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，以其相應(yīng)特征離子對作為檢測離子對進(jìn)行檢測，并以其相應(yīng)特征離子對的信噪比3∶1為對應(yīng)的檢出限濃度，檢測腺苷和唾液酸檢出限。

1.3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對照品溶液5 ml，連續(xù)進(jìn)樣6針，計算腺苷和唾液酸基峰面積的RSD，考察儀器精密度。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號1707201），于制備后2、4、6、8、12、18、24 h進(jìn)樣分析測定，記錄峰面積，考察供試品溶液的穩(wěn)定型。

1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號供試品（批號1707201），制備供試品溶液各6份，進(jìn)樣測定腺苷和唾液酸的峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值，考察方法的重復(fù)性。

1.3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密取同一批樣品（批號1707201）12份，分別精密加入高、中、低3個濃度水平的對照品溶液，制備“原液”和“稀釋液”供試品溶液，并分別測定唾液酸和腺苷的峰面積，計算回收率和RSD值。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

計算得腺苷回歸方程為：Y=19.588X+18.628，R=0.995，唾液酸回歸方程為：Y=123.77X+56.24，R=0.999，結(jié)果表明，腺苷和唾液酸進(jìn)樣濃度在0.25～32 μmol/L與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 選擇性和檢出限

本實(shí)驗(yàn)由于使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，具有檢測靈敏性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，選擇腺苷特征離子對266.1/133.8通道和唾液酸特征離子對308.2/87.1通道檢測，無測定干擾，故本方法有很高的靈敏性和特異性。測得的腺苷和唾液酸檢出限濃度分別為31.25 nmol/L和3.91 nmol/L。

2.3 精密度試驗(yàn)

腺苷和唾液酸基峰面積的RSD分別為1.39%和1.10%，說明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

腺苷和唾液酸峰面積的RSD分別為2.85%和1.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

腺苷和唾液酸的RSD分別為3.15%和2.29%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

腺苷和唾液酸的高濃度的平均加樣回收率為101.9%和98.3%，RSD分別為1.48%和1.86%；中濃度的平均加樣回收率為104.1%和101.3%，RSD分別為2.45%和0.81%；低濃度的平均加樣回收率為98.4%和102.2%，RSD分別為3.82%和1.78%。

2.7 樣品測定

以所建立的方法對3批9份樣品進(jìn)行測定，均檢出腺苷和唾液酸特征離子對，其含量計算數(shù)據(jù)見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考查了甲醇-水和乙腈-水為流動相，結(jié)果表明兩種流動相對兩種化合物均不能進(jìn)行分離，但甲醇-水溶液為流動相峰形最佳，為改善峰形，比較了加入不同比例甲酸和乙酸對分離效果的影響，結(jié)果表明流動相為甲醇-0.1%甲酸水時峰形最佳。由于兩個化合物較難進(jìn)行色譜分離，本實(shí)驗(yàn)采用了多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），通過母離子和子離子的雙重質(zhì)量篩選作用后，去除不符合規(guī)則離子信號的干擾，大大降低了基質(zhì)干擾，也避免了腺苷和唾液酸的相互干擾，圖1中可以看出，瓜蔞皮注射液與對照品溶液一樣，在各個檢測通道的基線非常平穩(wěn)。

腺苷是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)復(fù)陣發(fā)性室上性心動過速（PSVT）的一線藥物，它幾乎可以終止所有以房室結(jié)作為部分折返通路的PSVT[16]。經(jīng)測定腺苷在瓜蔞皮注射液中含量較高且批次間含量穩(wěn)定，因此建議增加腺苷為該制劑的質(zhì)量指標(biāo)。唾液酸雖然對心血管有一定的積極作用，但含量較低且批次之間含量差異較大，不建議作為指標(biāo)性成分。唾液酸批次之間含量差異大的原因可能是由于瓜蔞皮注射液中唾液酸的含量較低所致，另外唾液酸為糖蛋白帶電荷，瓜蔞皮注射液制備過程中提取條件及離子交換洗脫液的濃度、pH和洗脫速度等均有可能影響唾液酸的含量。

綜上所述，本研究首次建立了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速和準(zhǔn)確的HPLC-MS/MS分析方法，同時測定瓜蔞皮注射液中的腺苷和唾液酸成分的含量，可為進(jìn)一步完善瓜蔞皮注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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