蘇虹霞，段玉紅

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，由于胰島素作用障礙或者胰島素分泌缺陷導(dǎo)致持續(xù)高血糖，造成全身組織器官受到損傷，尤其是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的損害及其功能障礙和衰竭，嚴重者可并發(fā)酮癥酸中毒和高滲昏迷。目前，降糖西藥種類比較多，Ⅰ型糖和Ⅱ型糖降糖藥主要控制血糖，其作用強、起效快，但缺乏整體的協(xié)調(diào)性和安全性，產(chǎn)生諸多的副作用及并發(fā)癥。中藥具有副作用少、毒性小、療效穩(wěn)定、作用溫和等諸多優(yōu)點，尤其在防治糖尿病、炎癥、腫瘤等疾病方面，有西藥不能替代的綜合優(yōu)勢[1-2]。中藥發(fā)揮臨床療效，最主要的是多個小分子藥物通過與生物體靶蛋白結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用影響其生物學(xué)過程而起到治療作用。中藥的有效成分經(jīng)過提取分離，從分子水平(蛋白、基因)探討其藥理作用的過程比較復(fù)雜。隨著科學(xué)水平的提高，分子對接迅速發(fā)展，在中醫(yī)藥中廣泛應(yīng)用。分子對接將中藥、中藥復(fù)方、天然產(chǎn)物等小分子與疾病的關(guān)鍵靶點(蛋白)進行幾何匹配和能量匹配。查找空間和能量與之最佳契合的生物大分子，是快速的發(fā)現(xiàn)藥物作用潛在靶標的新方法。目前，被廣泛到應(yīng)用中醫(yī)藥領(lǐng)域中。

黃連解毒湯是中古代清熱解毒非常經(jīng)典的方劑，本方由寒性中藥(黃連、黃芩、黃柏)及梔子四味中藥組成，配伍劑量為3∶2∶2∶3。主要化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、三萜、脂肪酸類、黃酮類、生物堿類等，臨床應(yīng)用十分廣泛。藥理作用主要集中在降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗炎、抑制肝損害等作用，目前，研究者的不斷研究并結(jié)合臨床指導(dǎo)，黃連解毒湯的藥理作用和臨床應(yīng)用取得諸多新的進展[3-4]。通過實驗證明黃連解毒湯有很好的降糖作用[5]，但是其降糖化學(xué)成分及靶標蛋白并不明確，因此對其化學(xué)成分進一步的研究，基于分子模擬技術(shù)及黃連解毒湯降糖機理的研究現(xiàn)狀，篩選出降糖通路相關(guān)的6個靶標蛋白，嘗試從整體層面，運用分子對接技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，闡釋中藥功能描述與現(xiàn)代藥理之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 配體庫的構(gòu)建

本研究依據(jù)化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)和TCMSP[6](http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫的收錄情況挖掘黃連解毒湯中的化學(xué)成分。化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫是中科院上海有機化學(xué)研究所承擔(dān)建設(shè)的綜合科技信息數(shù)據(jù)庫的重要組成部分，可以提供化合物有關(guān)的命名、結(jié)構(gòu)、毒性、基本性質(zhì)、化學(xué)反應(yīng)、天然產(chǎn)物、相關(guān)文獻等信息。TCMSP(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺)該軟件將藥動學(xué)、藥效學(xué)、組學(xué)等進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建一個完整系統(tǒng)模型，為開展藥效學(xué)的預(yù)測、中藥藥理學(xué)和驗證研究提供平臺。同時也為靶點發(fā)現(xiàn)、新藥開發(fā)等提供新的研究方法。參照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥50%，類藥性(DL)≥0.18兩個條件，篩選同時符合兩個條件的化合物。陽性藥通過Drug Bank[7](https://www.drugbank.ca/about)進行查找，選擇已經(jīng)上市的藥為陽性藥。DrugBank數(shù)據(jù)庫屬“生物信息學(xué)+化學(xué)信息學(xué)”類資源，涵蓋了化學(xué)數(shù)據(jù)、藥物數(shù)據(jù)、藥理數(shù)據(jù)的詳細藥物數(shù)據(jù)，同時也包括藥物靶點信息。所有的化合物采用Chem Office、Open Babel-2.4.1等構(gòu)建成三維結(jié)構(gòu)，并對其加氫、加電荷，保存為mol2格式，作為虛擬篩選的配體庫[8]。

1.1.2 受體選擇

結(jié)合已有的臨床藥理實驗，選取了糖尿病發(fā)病機制各個環(huán)節(jié)中最關(guān)鍵和重要的靶點作為研究對象[9-10]，通過近10年文獻查找糖尿病相關(guān)受體過氧化酶活化增殖受體γ(PPARγ)、二肽基肽酶(DPP-IV)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、醛糖還原酶、α-葡萄糖苷酶和糖原合酶激酶-3(GSK-3)[11-13]。從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)得到3D晶體結(jié)構(gòu)，蛋白名稱、生物學(xué)效應(yīng)及原配等相關(guān)信息。PDB是藥物綜合數(shù)據(jù)庫和藥品基礎(chǔ)研發(fā)的信息的平臺。該數(shù)據(jù)庫由中國醫(yī)藥工業(yè)信息中心開發(fā)，是國內(nèi)覆蓋面最廣、信息量最大、應(yīng)用最方便的醫(yī)藥行業(yè)數(shù)據(jù)庫。詳見表1。

表1 靶標蛋白的基本信息

1.2 iGEMDOCK虛擬篩選

iGEMDOCK[14]是一個開源的分子對接軟件，操作簡單易用，對接準確度比較高，主要用于初篩和精度對接等。分子對接是將化合物分子放入受體蛋白配體結(jié)合位點，通過研究受體結(jié)構(gòu)特征及其與化合物分子之間作用力，依據(jù)讓兩者在幾何、能量上匹配的原則而相互識別，篩選出結(jié)合能量最低的分子。采用iGEMDOCK(GA parameters:Popula-tion size=200，Generation=70，Number of solution=2，Binding site radius=8)對化合物分子和受體蛋白的結(jié)合腔穴進行對接。蛋白質(zhì)上基團通過范德華力、氫鍵和靜電作用與化合物分子結(jié)合，匹配出能力最低的結(jié)合位點。能量函數(shù)根據(jù)對分子對接結(jié)果的范德華力、氫鍵和靜電作用統(tǒng)計，并將能量轉(zhuǎn)換成單位kcal/mol。

1.3 構(gòu)建多成分-蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)模型

采用Cytoscape2.8.1[15]軟件建立多成分-多蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)模型，Cytoscape源自系統(tǒng)生物學(xué)，用于將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)與高通量基因表達數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合在一起。其最強大的功能在于大規(guī)模蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用,蛋白質(zhì)-DNA或遺傳分子交互作用的分析。我們篩選出6個靶標蛋白，采用Cytoscape2.8.1中的網(wǎng)絡(luò)互作分析，從而得到不同數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)包括活性成分、蛋白2類節(jié)點(node)。若某一靶點為某化合物的潛在作用靶點，則以邊(edge)相連。在此基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，研究黃連解毒湯的多靶點作用及其類方潛在治療作用的各異性。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃連解毒湯化學(xué)成分

參照OB(≥50%)和類藥性(DL)≥0.18兩個條件，同時得到符合條件的化合物有22個，刪除黃柏和黃芩2個相同的化學(xué)成分，確定黃連解毒湯的主要化學(xué)成分19個。其有良好的類藥性和口服利用度。詳見表2。

表2 通過OB和DL預(yù)測的19個候選化合物信息

2.2 分子對接評分

iGEMDOCK軟件是可視化的藥物設(shè)計工具。在進行構(gòu)象搜索的過程中，該軟件主要采用經(jīng)驗打分函數(shù)。其結(jié)果以能量的高低去判斷與化合物結(jié)合程度，一般化合物分子與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量比較低，發(fā)生的作用可能性大[14]。將黃連解毒湯中19個化學(xué)成分與糖尿病中的6個靶標蛋白進行分子對接虛擬篩選，結(jié)果見表3～4。通過分子對接研究，6個靶標蛋白質(zhì)與黃連解毒湯中的19個化學(xué)成分有較好的結(jié)合作用，而且多數(shù)分子與受體結(jié)合的構(gòu)象比陽性對照物結(jié)合的構(gòu)象要穩(wěn)定。同時這些化學(xué)成分與多個靶標蛋白質(zhì)也都有較好的相互作用，進一步明確黃連解毒湯降糖的作用機制具有多途徑、多靶點。

表3 黃連解毒湯中化合物與受體PPARγ、DPP-IV、PTP1B對接結(jié)果(kcal/mol)

表4 黃連解毒湯中化合物與受體醛糖還原酶、α-葡萄糖苷酶、GSK-3對接結(jié)果(kcal/mol)

續(xù)表4

2.3 黃連解毒湯多成分-多蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)模型

黃連解毒湯中19個化學(xué)成分，與降糖6個靶標蛋白進行能量匹配，發(fā)現(xiàn)PPARγ、PTP1B、醛糖還原酶、α-葡萄糖苷酶、GSK-35個蛋白是黃連解毒湯發(fā)揮降糖的主要分子機制。黃連解毒湯中9個以上的化學(xué)成分(SudanIII，3-Methylkempferol，F(xiàn)umarine，(S)-Canadine，Moupinamide，Panicolin，NEOBAICALEIN等)同時調(diào)節(jié)這5個靶標蛋白，共同發(fā)揮降糖作用。而黃連解毒湯中19個化學(xué)成分和靶標蛋白DPP-IV結(jié)合的只有3個化學(xué)成分，明確DPP-IV可能不是黃連解毒湯發(fā)揮降糖的靶標蛋白。詳見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包括活性成分和靶點2類節(jié)點。

圖1 黃連解毒湯多成分-蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)模型注：黃色-靶標蛋白，藍色-化學(xué)成分

3 討論

黃連解毒湯是經(jīng)典的清熱解毒的方劑，臨床使用廣泛，隨著系統(tǒng)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，對黃連解毒湯治病機制的研究越來越深入。通過分子對接發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯中9個重要的化學(xué)成分，能同時與5個靶標蛋白(PPARγ、α-葡萄糖苷酶、PTP1B、醛糖還原酶、GSK-3)結(jié)合，發(fā)揮降糖作用。研究表明，人體內(nèi)糖尿病網(wǎng)絡(luò)存在著復(fù)雜的動態(tài)調(diào)控機制，多種因子、細胞因子參與調(diào)控，但是糖尿病相關(guān)受體發(fā)揮各自的的降糖作用。相互通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)機體平衡，靶標蛋白通過蛋白相互作用，關(guān)聯(lián)在一起，從而達到降低血糖的效果。中藥復(fù)方具有多成分，每個成分發(fā)揮的藥效不一致，調(diào)節(jié)的靶標蛋白也具有多樣性，這就導(dǎo)致復(fù)方的分子機制的復(fù)雜性。因為除了具有成分的多靶點作用，還有靶標蛋白的多靶點作用[15-17]。如果采用動物實驗進行篩選，將付出大量的人力和時間。目前，分子微觀闡釋階段的分子、藥理機制結(jié)合已成為中藥現(xiàn)代化研究的重要突破口。本實驗確定了黃連解毒湯中降糖的主要活性成分以及其主要的作用靶標，這有助于闡釋黃連解毒湯降糖的分子作用機制，明確臨床定位和提高臨床有效性及安全性評價與合理用藥，并為中藥復(fù)方提供一個新的研究策略，使用計算機從復(fù)雜體系中虛擬篩選出活性成分的方法簡單、時間短，從而降低研究費用，提高研究效率。