陳 濤

(1.陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710062； 2.桂林理工大學 教務處，廣西 桂林 541004)

三代蟲科屬扁形動物門、單殖吸蟲綱、多鉤亞綱、三代蟲目[1]，是一類常見的魚類體外寄生蟲，主要寄生在200種硬骨魚[2]及少數軟體類和兩棲類的體表[3-4]。全世界記錄的三代蟲已超過450種，潛在總物種數可能超過20 000種[5-8]。三代蟲科國內記錄了3屬60種[9-12]，其中三代蟲屬(Gyrodactylus)共58種、薄片吸蟲屬(Laminiscus)和擬三代蟲屬(Paragyrodactylus)各1種。三代蟲的繁殖方式為獨特的超胎生，即母體中已孕育子代，子代中又孕育第三代，甚至第四代，而其他單殖吸蟲為卵生[13-14]。三代蟲主要通過宿主間相互接觸傳播，短期內快速增殖，給宿主造成極大危害[15]。隨著魚類養(yǎng)殖密度不斷增大，三代蟲引起的疾病越來越嚴重，如G.salaris對挪威大西洋鮭(Salmosalar)的養(yǎng)殖造成了巨大的經濟損失[16]，國內三代蟲病的主要病原體是細鱗魚三代蟲(G.lenoki)、古雪夫三代蟲(G.gussvi)和小林三代蟲(G.kobayashii)等[17-19]。為了準確鑒定物種和防控三代蟲病，已開展了形態(tài)、分類、繁殖、宿主免疫、種群動態(tài)、線粒體基因組、系統(tǒng)進化及譜系地理等研究[6,20-22]。目前，三代蟲分類主要通過測量后吸器中央大鉤、邊緣小鉤和聯結片等骨化結構的形態(tài)特征，并結合分子標記鑒定[8,23]。筆者綜述了三代蟲的生物學特征、形態(tài)分類、分子標記及線粒體基因組等方面的研究現狀及發(fā)展趨勢，為生物學和分類學研究及病害防治提供基礎資料。

1 三代蟲的生物學特征

三代蟲雌雄同體，體長約0.6 mm。蟲體前端有一對頭器和刺狀感受器，無眼點；口位于頭器下方中央；咽后為食道及交配囊；體中部兩側腸分支；體中后部為生殖系統(tǒng)，包括卵巢、睪丸和卵黃腺等；體后端的后吸器由一對中央大鉤、背腹聯結片各1片及8對邊緣小鉤組成。

三代蟲通過后吸器的中央大鉤和邊緣小鉤附著，以寄主的黏液和分泌物為食，頭器的運動造成寄主損傷，進一步引起繼發(fā)感染，導致鰓、鰭潰爛及其他疾病。如大西洋鮭致命性病原體G.salaris對挪威的養(yǎng)殖和野生鮭魚種群造成極大危害，已被列為口岸檢驗物種[24]。G.salaris和G.turnbulli在實驗室連續(xù)培養(yǎng)研究超過5年和10年，受到極大關注，被稱為寄生蟲界的“果蠅”[25-26]。國內各養(yǎng)殖區(qū)均發(fā)現作為病原體的三代蟲，湖北和廣東尤為嚴重[27]。

1.1 三代蟲研究歷史

1832年，von Nordmann首次發(fā)現寄生于歐鳊(Abramisbrama)的三代蟲G.wangnei，誤將子宮中胚胎的大鉤理解為“胃鉤”[28]，隨后von Sieboldt第一次證實三代蟲為胎生繁殖[29]。

有關三代蟲早期的研究主要集中在染色體和胚胎細胞等方面[6]；后期逐漸成為魚類病原體而受到關注[30-31]，其中G.salaris不同程度地感染了挪威37條河流中的大西洋鮭[32]。1970年，Malmberg記錄的三代蟲超過200種，主要分布于歐洲、亞洲和北美洲[33]，目前已記錄的三代蟲超過450種[5-9]。

1948年，我國首次在鯽魚(Carassiusauratus)的體表發(fā)現了秀麗三代蟲(G.elegans)[1]，開啟了三代蟲研究，之后陸續(xù)有學者進行三代蟲分類研究，2012年賀懷亞等[10]整理三代蟲物種名錄，共52種，目前共記錄60種[9-12]。

1.2 三代蟲的性早熟和胎生

性早熟是三代蟲的一種生殖適應，其中胎生三代蟲高度性早熟[34]，三代蟲屬第一代出生僅需幾天，而卵生的O?egyrodactylusfarlowellae第一代出生則需幾周。Cable等[14]描述三代蟲雌性生殖系統(tǒng)早熟時，發(fā)現其他單殖吸蟲包括卵生三代蟲的雌性生殖系統(tǒng)包含大量的卵黃腺，而胎生三代蟲僅存在一個簡單的細胞體。胎生三代蟲的雌性生殖系統(tǒng)早熟，而其他單殖吸蟲則是雄性生殖系統(tǒng)早熟。胎生的Macrogyrodactylus屬極少出現性早熟，需經歷較長的胚后分化，特別是體后部的腺組織和表皮細胞[35]，而Isancistrum屬的性早熟縮短生命周期，導致后吸器缺失中央大鉤和聯結片，其他系統(tǒng)也簡化。胎生作為另外一種重要生殖適應，可減少世代獲得時間，最終損失卵殼。

1.3 三代蟲的表皮和附著器

具有表皮合胞體的三代蟲物種包括G.gasterostei、G.eucaliae、G.turnbulli和G.bullatarudis等[35-36]。胎生種類的表皮有細胞核，而其他單殖吸蟲表皮無細胞核。G.eucaliae表皮細胞產生兩種不同的分泌囊泡[36]，而Macrogyrodactylusclarii產生3種囊泡[37]。三代蟲外胞質層缺少細胞核、線粒體、高爾基體，而內質網僅出現在皮下細胞。

胎生三代蟲主要通過后吸器的邊緣小鉤附著，而中央大鉤和腹聯結片則作為分類結構。寄主體表肌肉組織舒張時，三代蟲中央大鉤轉動并移動腹聯結片起到壓力板作用，防止后吸器和中央大鉤滑落[38]。較大的卵生三代蟲O.farlowellae需更強的附著力，防止從寄主體表滑落，因此以中央大鉤附著為主，而邊緣小鉤僅起輔助附著的作用[34]。G.poeciliae邊緣小鉤鉤尖長度小于1 μm，容易從寄主體表滑落，而G.milleri牢固的邊緣小鉤可長期附著在相同寄主體表[39]，因此三代蟲屬物種傾向于通過邊緣小鉤附著，中央大鉤用作壓力板，Isancistrum屬和Anacanthocotyle屬三代蟲缺少中央大鉤和聯結片，僅以邊緣小鉤附著[3,40]，而體更長的Macrogyrodactylus、Swingleu、Polyclithrum、Mormyrogyrodactylus屬三代蟲則以后吸器附著[41]。寄生于爪蟾蜍(Xenopuslaevis)的三代蟲G.gallieni也以后吸器附著。

1.4 三代蟲體內主要系統(tǒng)

消化系統(tǒng)：三代蟲主要以寄主的表皮細胞和黏液為食，腸兩側分支末端封閉，除Isancistrum屬外均具有合胞體[34,42]，而Isancistrum屬腸分支末端融合成環(huán)狀。三代蟲腸表皮無細胞核，而許多細胞質內含不同的消化囊泡[43]。G.salaris直接以寄主表皮細胞為食，G.gasterostei每15～30 min進食一次，可吞食一塊含30個細胞的表皮[6]。

腺系統(tǒng)：Wagener[44]首次描述三代蟲的腺體及分布，隨后Kritsky[45]將三代蟲G.eucaliae中的腺體分為3種類型：3對背部兩側對稱腺體群產生的酸性分泌物、1組咽之后的后腹部腺體分泌的顆粒酸性分泌物及1對前腹部腺體群產生堿性分泌物, 而頭腺主要起黏附作用。

排泄系統(tǒng)：包括2個縱向環(huán)狀通道和來自單個焰細胞的接收小導管，焰細胞和導管結構與其他扁形動物的相似[14]。

神經系統(tǒng)：早期使用硫代膽堿法描述三刺魚(Gasterosteusaculeatus)的未命名三代蟲的神經系統(tǒng)[46]，隨后通過免疫細胞化學揭示G.salaris存在正交神經索特征[47]，而共聚焦掃描電鏡揭示M.clarii的肌肉空間排列和相關膽堿、肽和胺類神經分布[48]。

生殖系統(tǒng)：三代蟲的雄性生殖系統(tǒng)由睪丸和雄性生殖器組成。球形的雄性生殖器由前列腺和射精管組成交配囊，內含大刺和小刺。卵生Ooegyrodactylus屬和非洲胎生三代蟲屬具有管狀雄性生殖器[49]；Mormyrogyrodactylus屬具有觸須形管狀結構[41]，可延伸到體外，功能類似雄性外生殖器；Nothogyrodactylus、Aglaiogyrodactylus、Onychogyrodactylus屬的雄性生殖器周圍包括輔助的骨片。卵生屬具有2個形狀不同的精囊[50]，而胎生屬的精囊僅1個。卵生的O.farlowellae雌性生殖系統(tǒng)包括位于睪丸之后的1個卵巢，通過雌性輸卵管向體外側開口，開口作為成體的陰道，受精即雄性生殖器插入陰道[34]，卵黃腺未完全發(fā)育。胎生三代蟲最明顯的是子宮，卵巢則簡化為精巢的后壁，缺乏獨立連接的雌性或雄性生殖系統(tǒng)通道。

三代蟲的子代突破體壁[35]，之后體壁愈合，留下永久的雌性開口。G.turnbulli直接將雄性生殖器插入同種三代蟲體內，開始交配，雄性生殖器抓緊對方后相互受精[51]，而卵生三代蟲的受精則是雄性生殖器直接插入對方的子宮孔[35]。

2 三代蟲形態(tài)分類

三代蟲的形態(tài)分類主要依據后吸器中央大鉤和背腹聯結片，其中腹聯結片在識別新種上起決定作用。影響中央大鉤和聯結片發(fā)育的因素包括季節(jié)、寄主和附著位點[52]，其中低溫能延長胚胎發(fā)育時間，是導致三代蟲中央大鉤變大的一個因素。

1946年Sproston僅通過邊緣小鉤識別秀麗三代蟲或中型三代蟲(G.medius)，但該方法不可靠，產生了許多錯誤記錄[53]。直至1970年Malmberg[33]首次基于排泄系統(tǒng)并補充邊緣小鉤作為鑒定依據，正式提出三代蟲屬的分類系統(tǒng)，將其分為六個亞屬：三代蟲亞屬(Gyrodactylus)、Mesonephrotus、Paranephrotus、Metanephrotus、Neonephrotus和Limnonephrotus，但該分類系統(tǒng)基于寄主和寄生蟲的協(xié)同進化，缺點是缺乏單獨特征來確定排泄系統(tǒng)的進化方向，物種分布僅限于歐洲斯堪的納維亞半島，且只能研究活體，而許多北美洲和亞洲物種可能屬于已存在的種群，但未被完整描述而難以證實。

2.1 三代蟲科的分類

三代蟲科最初僅包括胎生的三代蟲屬，之后Fuhrmann[54]發(fā)現，Isancistrinae亞科Isancistrum屬缺少中央大鉤和聯結片，Polyclithrinae亞科Polyclithrum屬的后吸器出現較多的聯結片，其他屬統(tǒng)稱為三代蟲亞科，但這些亞科主要基于形態(tài)分類，可能并未真實反映物種關系。根據生殖方式的不同，三代蟲科分為卵生和胎生兩科，后期研究發(fā)現，獨立的卵生科Ooegyrodactylidae為并系群[34]，因此卵生科應屬于三代蟲科[6]。目前三代蟲科包括4個亞科：Isancistrinae、Gyrdactylinae、Macrogyrodactylnae和三代蟲亞科[1]。

2.2 三代蟲屬的分類

根據形態(tài)分類標準及繁殖方式差異，三代蟲科分為30個屬[6]，包括7個卵生屬(Aglaiogyrodactylus、Hyperopletes、Ooegyrodactylus、Phanerothecium、Phanerothecioides、Nothogyrodactylus和Onychogyrodactylus)和23個胎生屬(Afrogyrodactylus、Accessorius、Acanthoplacatus、Anacanthocotyle、Archigyrodactylus、Fundulotrema、Gyrdicotylus、Gyrodactyloides、三代蟲屬、Isancistrum、Macrogyrodactylus、Mormyrogyrodactylus、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Metagyrodactylus、Polyclithrum、Micropolyclithrum、Scleroductus、Swingleus、擬三代蟲屬、Paragyrodactylus、Paragyrodactyloides和薄片吸蟲屬)，其中胎生屬中的7個屬由于重名或同物異名，屬于無效命名，分別為：Paragyrodactyloides、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Micropolyclithrum、Fundulotrema、Metagyrodactylus和Afrogyrodactylus[6,55-56]。因此三代蟲科有效屬為23個，包括7個卵生屬和16個胎生屬，其中卵生屬三代蟲僅感染南美的條紋鴨嘴鲇(Pseudoplatystomafasciatum)和蜥形克隆甲鲇(Kronichthyslacerta)，國內三代蟲科僅包括三代蟲屬、薄片吸蟲屬和擬三代蟲屬[9-10]。胎生屬中體長最短的Isancistrum屬約0.1 mm、三代蟲屬約0.6 mm、最長的Macrogyrodactylus屬約1.5 mm。擬三代蟲屬和三代蟲屬的主要區(qū)別在于中央大鉤基部具有類似頭盔狀的骨片[9]。

3 三代蟲的分子標記

1991年Wilson[57]用分子標記研究三代蟲分類學和系統(tǒng)學，隨著致病性的G.salaris威脅擴大，傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法難以鑒定該物種，隨后使用分子標記鑒定致病和其他非致病性的G.salaris[58]。津巴布韋、南非、墨西哥和中國等國家的學者也使用分子標記研究本地三代蟲，發(fā)現了許多新種[8-9,59]。

3.1 核內分子標記

首個分子標記是核內核糖體18S rDNA的V4可變區(qū)，用于鑒別致病性的G.salaris和非致病性的G.truttae及G.derjavini，但難以區(qū)分G.thymalli和G.teuchis。隨后提出測定內轉錄間隔區(qū)和核糖體5.8S rDNA，其中序列高度保守的5.8S rDNA成為屬內鑒定的合適標記[60]。也有研究使用內轉錄間隔區(qū)構建三代蟲屬系統(tǒng)進化關系[61]，同時通過內轉錄間隔區(qū)的屬級系統(tǒng)進化關系可用于評價亞屬和種群的有效性[60]，內轉錄間隔區(qū)序列還可用于驗證基于排泄系統(tǒng)和邊緣小鉤確立的三代蟲亞屬分類系統(tǒng)，支持三代蟲亞屬、Neonephrotus和Limnonephrotus亞屬為單系群，未支持其他3個亞屬作為單系群[6]。內轉錄間隔區(qū)比28S變異大，優(yōu)于V4可變區(qū)，已使用內轉錄間隔區(qū)測定128個種，比較適合歐亞淡水魚類的G.wageneri種團[6,8-9]。

核內分子標記也存在一些不足：內轉錄間隔區(qū)序列變異大，存在插入或缺失，不適合屬級系統(tǒng)進化分析，適合復雜的種內鑒定；5.8S rDNA更適合屬級比較，但序列太短；18S rDNA的V4可變區(qū)包含充足的變異，但序列也較短；序列較長的18S和28S更適合科級水平系統(tǒng)進化；核糖體基因間隔區(qū)仍存在協(xié)同進化的制約，也未能成為單獨的分子標記。

3.2 線粒體基因分子標記

用線粒體基因標記分析三代蟲G.salaris進化的是COⅠ基因[62]，與核糖體基因標記相比，COⅠ基因突變率高，進化速率更快，可用于檢測內轉錄間隔區(qū)數據的有效性，也是重建三代蟲物種形成不可或缺的分子標記，但受線粒體基因核復制數和假基因影響，仍需更多的分子標記構建系統(tǒng)進化分析和物種鑒定。目前還使用線粒體NA5和COⅡ基因研究三代蟲分類及譜系地理[22，63]。

4 三代蟲線粒體基因組

目前已測定9種三代蟲的全線粒體基因組，包括卵生Aglaiogyrodactylus屬1種，胎生的三代蟲屬7種和擬三代蟲屬1種，分別為G.thymalli、G.salaris、G.derjavinoides、G.kobayashii、G.brachymystacis、G.parvae、G.gurleyi、Paragyrodactylusvariegatus和Aglaiogyrodactylusforficulatus[64-65]。線粒體基因組長度為14 371～14 790 bp，均包含12個蛋白編碼基因、22個轉運RNA基因、2個核糖體RNA基因及1～2個不等的非編碼區(qū)。最短的卵生屬A.forficulatus為14 371 bp，2個非編碼區(qū)序列長度分別為485 bp和733 bp，A+T的總含量為75.12%；中等長度的胎生擬三代蟲屬P.variegatus為14 517 bp，1個主要的非編碼區(qū)序列長度為1093 bp，A+T的總含量為76.3%，最長的為胎生三代蟲屬G.salaris為14 790 bp，2個非編碼區(qū)序列長度分別為799 bp和768 bp，A+T的總含量為65%，明顯低于A.forficulatus和P.variegatus。卵生屬A.forficulatus線粒體基因組長度最短，其次為胎生擬三代蟲屬P.variegatus，最長的為胎生三代蟲屬G.salaris。系統(tǒng)進化分析表明，卵生屬A.forficulatus位于三代蟲科最基部，之后為擬三代蟲屬P.variegatus，最后為三代蟲屬物種[65]。

5 形態(tài)結合分子分類

目前三代蟲的分類主要根據后吸器中央大鉤和聯結片的形態(tài)特征及測量數據并結合分子標記，主要用于鑒定新種和對已知種的分子確認及研究基因流、遺傳漂變、種群分化，探討形態(tài)特征是否真實反映物種進化，還是屬內或種內多樣性及環(huán)境影響[59, 66-67]。其中基于內轉錄間隔區(qū)rDNA序列推斷三代蟲屬4個亞屬的系統(tǒng)進化表明，每個三代蟲屬亞屬都有唯一的5.8S基因序列，同時種的水平上表現在后吸器形態(tài)和尺寸差異很低，但內轉錄間隔區(qū)的分子差異卻很高，因此可用內轉錄間隔區(qū)鑒定物種[68]。此外，通過測量后吸器中央大鉤及邊緣小鉤的主要參數并結合分子標記研究津巴布韋、南非、墨西哥、保加利亞、中國等國家本地三代蟲，發(fā)現了許多新種[8-9，11-12，59，66-69]。因此，通過形態(tài)學測量后吸器的骨化結構的形態(tài)特征并結合分子標記仍然是未來鑒定三代蟲新種的主要方法。

6 展 望

三代蟲研究已取得的進展包括建立屬級和科級分類系統(tǒng)、鑒定許多新種及開展相關譜系地理研究，但這對于潛在超過20 000種的三代蟲分類和疾病防治還存在很大差距，特別是國內許多省區(qū)三代蟲研究還存在空白。今后應加強形態(tài)學結合分子數據聯合的生物學和分類學研究，尋找更多特異性分子標記，對其分布、傳播、繁殖以及室內培養(yǎng)等進行深入研究、并逐步完善國內分類系統(tǒng)，為三代蟲的生物學、分類學、新種鑒定及病害防治提供科學依據和理論指導。