劉淵 董云霞 白建霖

【摘 要】 目的：優(yōu)化五味清肺固本膠囊的提取工藝。方法：以總多糖、總生物堿和干膏得率為綜合評分指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)考察浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對五味清肺固本膠囊提取工藝的影響并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最佳提取工藝為加水總倍量32倍，浸泡0.5h，提取3次，提取總時(shí)間為3h；3批驗(yàn)證樣品的綜合評分分別為0.9330、0.9443、0.9242（RSD=1.08，n=3）。結(jié)論：采用多指標(biāo)綜合評分-正交試驗(yàn)法優(yōu)化的工藝方法科學(xué)合理、可行，適合生產(chǎn)要求，該工藝的改進(jìn)也有利于控制制劑總多糖和總生物堿的含量。

【關(guān)鍵詞】 多指標(biāo)綜合評分；正交試驗(yàn)；總多糖；總生物堿；五味清肺固本膠囊

【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）14-0031-05

Abstract：Objective To optimize extraction process of Wuwei Qingfei Guben capsules. Method The extraction process of Wuwei Qingfei Guben capsules was optimized by L9（34） orthogonal test with soaking period， amount of water added，extracting time and times as factors using the total polysaccharide， total alkaloids and dry extract yield as indexes，and the verification test was made. Result The best extraction process was as follows as soaking period 0.5h， total 32-fold water， extracting for 3 times，total extracting time 3h；comprehensive score of 3 batches of samples in validation test were 0.9330，0.9443and 0.9242（RSD=1.08，n=3）. Conclusion The extraction process optimized by multi-index comprehensive score-orthogonal test is scientific， reasonable and suitable for production requirements，the process improvement is in favor of controlling the content of total polysaccharide and total alkaloids.

Keywords：Multiindex Comprehensive Score；Orthogonal Test；Total Polysaccharide；Total Alkaloids；Wuwei Qingfei Guben Capsules

五味清肺固本膠囊是蘭州市肺科醫(yī)院傳統(tǒng)制劑，處方由白及、百部、冬蟲夏草等5味中藥組成，具有滋肺益腎、止咳化痰、消腫生肌的功效。方中百部的主要活性成分為百部生物堿，是百部科植物所特有的吡咯或吡啶并氮雜薁母核結(jié)構(gòu)的生物堿，有殺蟲、鎮(zhèn)咳平喘、抗腫瘤和抗菌等藥理作用[1]；白及的主要活性成分為多糖類，有收斂、止血、消腫生肌等作用[2]。五味清肺固本膠囊是在散劑的基礎(chǔ)上經(jīng)過劑型改造發(fā)展而來，原制劑服用量大而患者的依存性較差，對制劑的臨床使用有一定的影響。研究采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，依據(jù)中藥復(fù)方藥理作用的整體性，中藥成分和作用機(jī)制復(fù)雜性的作用特點(diǎn)，主要對制劑生產(chǎn)中的總生物堿、總多糖的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行考察，并在制備過程中采用精制除雜，可以減少制劑的服用量，同時(shí)符合中藥現(xiàn)代化的要求。以多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選提取工藝條件的實(shí)驗(yàn)研究，也為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了基礎(chǔ)[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450紫外分光光度計(jì)（島津）；FA2004B電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 材料 藥材均購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)楊懷武高級工程師鑒定均符合《中國藥典》2015 年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定；三批樣品為我院實(shí)驗(yàn)中心自制，批號分別為20171210、20171211、20171212；D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201205，中國食品藥品鑒定研究所）；對葉百部堿對照品（批號：6879-01-2，上海源葉生物科技有限公司）；純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 干膏得率的測定 按照L9（34）正交表安排進(jìn)行提取操作，100目篩趁熱過濾，合并提取液，濃縮后定容到250mL量瓶中，精密量取50 mL，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，取出至干燥器中冷卻30 min、迅速精密稱定，計(jì)算干膏得率。

2.2 總多糖含量的測定[4-8]

2.2.1 供試品溶液的配制 精密稱取正交試驗(yàn)6號樣品浸膏粉約0.15g，置于10mL容量瓶中，加水充分溶解并定容至刻線，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3500r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5min，精密吸取上清液1mL于離心管中，加入無水乙醇9mL，至刻以3500r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10min，傾去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次后，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容至刻線，搖勻即得。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖對照品11mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻線，搖勻即得濃度為0.22mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和D-無水葡萄糖對照品溶液適量于10mL具塞試管中，加水至2mL，分別加入5%苯酚溶液1mL和濃硫酸5mL，搖勻后于60 ℃水浴保溫30min，取出，放至室溫，以水為空白，按照紫外—可見分光光度法在200～800nm進(jìn)行掃描，結(jié)果D-無水葡萄糖對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為490nm，故選擇490nm為檢測波長。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取0.22mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液5mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻線，搖勻，即得濃度為0.11mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，按“2.1.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長490nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度（x，μg·mL-1）橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程為y=0.0574x+0.0101（r2=0.9980）。結(jié)果表明D-無水葡萄糖在2.75～13.75μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.3mL于6支具塞試管中，加水至2mL，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長490nm處測定吸光度并計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=1.55%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法處理后，分別在0、15、30、45、60、90、120min測定其吸光度并計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=0.17%（n=7），表明該方法處理后的溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長490nm處測定吸光度，并計(jì)算樣品中總多糖含量的RSD。結(jié)果RSD=2.56%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備后，分精密吸取0.5mL于具塞試管中，共9份，分別精密加入0.22mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液0.8、1.0、1.2mL，加水至2mL，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長490nm處測定吸光度并計(jì)算總多糖含量及加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果平均加樣回收率為101.16%，RSD=1.88%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表1。

2.2.9 樣品中總多糖含量的測定 精密稱取L9（34）正交試驗(yàn)樣品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備并按“2.2.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長490nm處測定吸光度，計(jì)算樣品中總多糖含量。

2.3 總生物堿含量的測定[9-10]

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取正交試驗(yàn)6號樣品浸膏粉約1g于錐形瓶中，加甲醇25mL，超聲處理30min，過濾，濾液定容于25mL容量瓶中，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取對葉百部堿對照品19.5mg于25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻線，搖勻，即得0.78mg·mL-1 的對葉百部堿對照品溶液。

2.3.3 檢測波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液適量于分液漏斗中，加入pH 6.6磷酸鹽緩沖液5mL和溴百里香酚藍(lán)試液3mL，搖勻，用氯仿萃取2次，每次10mL，取下層液于25mL容量瓶中，用氯仿定容至刻線，搖勻。以甲醇為空白試劑，按照紫外—可見分光光度法在200～800nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對葉百部堿對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為412nm，故選擇412nm為檢測波長。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取對葉百部堿對照溶液1mL，按“2.3.3”項(xiàng)下的方法處理，分別取2、4、6、8、10mL于具塞試管中，加氯仿至10mL，搖勻，以甲醇為空白試劑，于412nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度（x，μg·mL-1）橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程為y=0.0262x-0.1001（r2=0.9987）。結(jié)果表明對葉百部堿在6.24～31.2 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對葉百部堿對照溶液1mL于分液漏斗中，共6份，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法處理后，在波長412nm處測定吸光度并計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=1.20%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1mL于分液漏斗中，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法處理后，分別在0、10、20、30、40、60、90min測定其吸光度并計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=0.24%（n=7），表明該方法處理后的溶液在90min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的方法制備的供試品1mL，共6份，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法處理后，測定吸光度并計(jì)算樣品中總生物堿含量的RSD。結(jié)果RSD=1.10%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的方法制備的供試品0.5mL，共9份。分別精密加入0.78mg·mL-1的對葉百部堿對照品溶液0.28、0.35、0.42mL，按“2.2.4”項(xiàng)下的方法處理后，測定吸光度并計(jì)算總生物堿含量及加樣回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果平均加樣回收率為101.60%，RSD=2.13%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表2。

2.3.9 樣品中總生物堿含量的測定 精密稱取L9（34）正交試驗(yàn)樣品適量，按“2.3.1”項(xiàng)下的方法制備并按“2.3.3”項(xiàng)下的方法處理后，在波長412nm處測定吸光度，計(jì)算樣品中總生物堿含量。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝及結(jié)果 依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，確定本組方藥效成分為水溶性成分，因此設(shè)計(jì)提取溶劑為水。按處方比例稱取百部、白及等藥材共94.5g（除冬蟲夏草），共9份。選用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)處方中藥材有效成分的作用，以浸泡時(shí)間、加水總倍數(shù)、提取總時(shí)間和提取次數(shù)作為考察因素，以總多糖提取率、總生物堿提取率和干膏得率作為考察指標(biāo)，因素與水平（見表3）。利用SPSS 19.0對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（見表4、5）。由極差分析結(jié)果可知，各因素對綜合評分的影響大小順序?yàn)镃>D>B>A；由方差分析可知，因素C、D對綜合評分具有極顯著性影響（P<0.01），因素B對綜合評分具有顯著性影響（P<0.05），因素A對綜合評分無顯著性影響（P>0.05）。綜合分析得出最優(yōu)提取工藝為A1B3C3D3，即總加水32倍，浸泡0.5h，提取3次，提取總時(shí)間為3h。

2.5 權(quán)重系數(shù)及綜合評分公式的確定[11-12] 采用層次分析法（Analytic Hierarchy Process，AHP）并綜合考慮五味清肺固本膠囊的現(xiàn)代藥理研究，得到總生物堿、總多糖和出膏率的AHP法權(quán)重系數(shù)分別為0.5815、0.3090、0.1095，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，其一致性比率（CR）=CI/RI =0.0036/0.58=0.0062 < 0.1，表明指標(biāo)優(yōu)先比較判斷陣距具有一致性，權(quán)重系數(shù)合理、有效。最終得到的綜合評分=總生物堿提取率/最大總生物堿提取率×0.5815+總多糖提取率/最大總多糖提取率×0.3090+出膏率/最大出膏率×0.1095。

2.6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按比例稱取同一批百部、白及等藥材適量，平行3份，按照最優(yōu)工藝進(jìn)行提取。結(jié)果平均出膏率為43.91%，RSD為1.50%；平均總多糖提取率為4.96%，RSD為2.10%；平均總生物堿提取率為0.50%，RSD為0.90%；平均綜合評分0.9338，RSD為1.08%，表明該工藝穩(wěn)定可行。見表6。

3 討論

3.1 有效部位的確定和多指標(biāo)綜合評分 五味清肺固本膠囊由白及、百部、冬蟲夏草等5味中藥組成，藥效成分主要為生物堿、多糖等成分。本提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)是建立在中藥藥效學(xué)和復(fù)方制劑藥效的整體性、多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，貫穿質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的思路，充分考慮五味清肺固本膠囊中百部、白及等藥材的藥效部位，如抑菌、止咳平喘、止血等成分的理化性質(zhì)與提取溶劑、提取方法的關(guān)系，以總生物堿、總多糖和干膏得率為評價(jià)目標(biāo)，結(jié)合層次分析法確定各指標(biāo)權(quán)重，采用多指標(biāo)綜合評分法分析優(yōu)選提取工藝。

3.2 制備工藝和檢測方法的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)在五味清肺固本膠囊的制備中采用傳統(tǒng)的溶劑提取法，在提取液多糖的制備過程中，利用多糖溶于水而不溶于無水乙醇的性質(zhì)，采用兩步離心法結(jié)合醇沉法，第一步對提取液的離心可以較大程度的除去其中的蛋白質(zhì)、糊化淀粉、油脂等雜質(zhì)；第二步是用90%的醇沉后離心，以此降低多糖純化成本，也可以減少多糖類成分的損失；在總多糖含量測定方法的選擇上，選用簡便、靈敏度高的苯酚-硫酸法，進(jìn)一步避免了復(fù)方提取液中蛋白質(zhì)等成分對含量測定的影響。選用酸性染料比色法測定百部總生物堿的含量，該方法是離子對萃取比色法中比較經(jīng)典方法，以溴百里香酚藍(lán)為酸性染料亦最大程度地減少對檢測結(jié)果干擾。

3.3 工藝優(yōu)選對臨床應(yīng)用和制劑質(zhì)量的影響 五味清肺固本膠囊是在散劑的基礎(chǔ)上通過劑型改造發(fā)展而來，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝最大限度的保證了藥材中藥效部位提取程度，也保證了制劑的臨床療效。同時(shí)，經(jīng)過精制除雜過程，除去了提取液中的一些蛋白類、淀粉等物質(zhì)，較原制劑減少了服用量，提高患者的用藥依存性。通過對提取工藝的研究，在制劑的生產(chǎn)過程中，可以用總多糖和總生物堿作為中間品控制的定量指標(biāo)，進(jìn)一步提升制劑的質(zhì)量。

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（收稿日期：2018-05-18 編輯：程鵬飛）