柴國祥 韓斌孝 孫建軍 章國平 楊永紅 王磊 牛晨霞 李興芳 徐英春

我國是結(jié)核病高發(fā)的國家之一, 對結(jié)核病的防治與治療是一項長期的研究工作［1］。而近年來, 新耐藥結(jié)核的出現(xiàn),結(jié)核病的防治又出現(xiàn)了新挑戰(zhàn)［2］。因此, 對于結(jié)核病的診斷能力加強也是當前結(jié)核病控制的一個重點。對結(jié)核病的檢查中, 細菌學的檢查是作為該病診斷的金標準, 傳統(tǒng)檢查應用的抗酸染色涂片的檢查敏感性較低僅為9%~35%, 分枝桿菌的復合群快速培養(yǎng)平均報陽較低, 也難滿足臨床上對結(jié)核病的快速診斷需求［3,4］。因此, 本研究通過采用RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術, 對疑似為結(jié)核病的患者痰樣本進行檢測分析, 結(jié)果對比痰菌培養(yǎng)及痰涂片檢查結(jié)果, 研究取得一定成果, 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2016年2月~2018年2月收治的疑似肺結(jié)核病患者400例作為研究對象, 其中男243例, 女157例；年齡13~78歲, 平均年齡(43.47±11.51)歲；400例疑似肺結(jié)核病患者中依據(jù)《肺結(jié)核和治療指南》的診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者183例, 依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、結(jié)合病理學分析、痰涂片與培養(yǎng)等診斷為其他肺部疾病患者217例。

1. 2 方法

1. 2. 1 痰抗酸桿菌涂片與痰分枝桿菌的培養(yǎng) 選擇BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)法對患者痰樣本采集、分離與預處理, 并對痰分枝桿菌分別進行涂片與培養(yǎng)。

1. 2. 2 樣本處理 400例疑似肺結(jié)核病患者通過RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術進行檢測。RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒(上海仁度生物技術有限公司, 批號：20130407)。痰樣本采集、分離與預處理。取得待測標本11400×g高轉(zhuǎn)速離心機下進行離心5 min, 并除去上清液；后加入1 ml的生理鹽水進行洗滌, 再次除去上清液；并加入濃度為50 μl的人淋巴毒素β(LTB)稀釋液進行重懸,超聲處理15 min, 11400×g高轉(zhuǎn)速離心機下重復進行離心5 min, 備用。

1. 2. 3 擴增檢測 取2 μl的處理物加入到30 μl的擴增檢測液當中。檢測前對微量反應管進行恒溫預熱, 在60℃溫度下預熱10 min后, 轉(zhuǎn)至42℃溫度下進行預熱5 min；同時對實時熒光核酸恒溫擴增酶液進行預熱至溫度達到42℃。預熱結(jié)束后, 對每支反應管單獨加入10 μl的實時熒光核酸恒溫擴增酶液, 并進行充分混勻, 反應管同時快速轉(zhuǎn)到熒光定量PCR儀(7500 FAST, 美國ABI)當中。熒光定量PCR儀反應程序熒光通道設定FAM, 42℃下、1 min, 進行40個循環(huán)；熒光信號收集以1 min 1次。H37Ra菌株為陽性對照, 以無菌水為陰性對照。

1. 3 觀察指標及判定標準 以樣本的曲線與閾值的曲線產(chǎn)生的交叉點橫坐標讀數(shù), 即樣本檢測時間為DT, 當DT≤35 min則檢測為陽性；當DT >40 min則檢測為陰性；其中中間讀數(shù)以重新檢測, 并記錄復測值。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 檢測結(jié)果分析 以臨床診斷結(jié)果為金標準, RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測出結(jié)核病患者陽性133例, 涂陽患者61例, 涂陰72例, 敏感度為72.68%, 特異度為98.62%。實時熒光核酸恒溫擴增檢測的符合率為86.75%, 顯著高于痰分枝桿菌的培養(yǎng)(69.75%)和痰抗酸桿菌涂片(67.50%), 差異具有統(tǒng)計學的意義(P＜0.05)。其中實時熒光核酸恒溫擴增檢測的3例非陰性陽性, 涂片均為陽性。見表1。

2. 2 不同肺結(jié)核患者的實時熒光核酸恒溫擴增檢測結(jié)果 183例診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者中, 涂陽培陽患者實時熒光核酸恒溫擴增檢測檢出率為100.00%, 涂陰培陽患者檢出率為78.95%, 涂陰培陰患者檢出率為56.00%, 涂陽培陰患者檢出率為40.00%。見表2。

表1 肺結(jié)核檢測結(jié)果(n)

表2 不同肺結(jié)核患者的實時熒光核酸恒溫擴增檢測結(jié)果(n, %)

3 討論

肺結(jié)核作為高發(fā)病率的疾病, 其發(fā)現(xiàn)率卻僅在40%左右。對于結(jié)核患者進行快速的診斷是結(jié)核防控項目的一個重點, 以往常規(guī)檢測方法往往很難達到快速診斷的效果［5］。而在近年來, 隨著技術的改進, 熒光定量PCR技術逐漸應用到肺結(jié)核的檢驗當中, 該技術能快速、高效的進行診斷。本研究采用RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術, 其檢測優(yōu)點在于能夠直接的以結(jié)核分枝桿菌的特異性RNA作為擴增的靶標, 并以擴增的產(chǎn)物RNA作為檢測的靶標, 因為RNA僅在活菌當中才能存在, 在結(jié)核分枝桿菌死亡后, RNA會降解。因此, 該方法可以實現(xiàn)對活動性的肺結(jié)核及該病的治療效果監(jiān)測。通過400例疑似結(jié)核痰樣本研究結(jié)果顯示, 以臨床診斷結(jié)果為金標準, RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測出結(jié)核病患者陽性133例, 涂陽患者61例, 涂陰72例, 敏感度為72.68%, 特異度為98.62%。實時熒光核酸恒溫擴增檢測的符合率為86.75%, 顯著高于痰分枝桿菌的培養(yǎng)(69.75%)和痰抗酸桿菌涂片(67.50%), 對比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測的3例非陰性陽性, 涂片均為陽性。183例診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者中, 涂陽培陽患者RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測檢出率為100.00%, 涂陰培陽患者檢出率為78.95%, 涂陰培陰患者檢出率為56.00%,涂陽培陰患者檢出率為40.00%。研究結(jié)果均顯示RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測能有效的對結(jié)核病進行檢測。

綜上所述, RNA實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術對檢測肺結(jié)核病具快速、便捷、經(jīng)濟和高敏感度等特點, 該方法值得在臨床的結(jié)核篩查中進行應用。