李文兵，白進(jìn)玲，王 穎，張宗英，吳學(xué)宏，韓成貴

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京100193）

甜菜苗期主要病害是立枯病[1]。2014年4月底5月初，我國河北省和內(nèi)蒙古兩地大面積甜菜種植區(qū)苗期甜菜葉片上出現(xiàn)一種新的葉部枯斑病害，癥狀為子葉和真葉上出現(xiàn)枯斑，中心黃白色，有紫色暈圈，一般在育苗棚滴水處形成發(fā)病中心（如圖1）。河北省張家口地區(qū)張北糖廠紙筒育苗面積14萬畝（9330 hm2）中約2萬畝（1330 hm2）發(fā)生此病害，內(nèi)蒙古集寧地區(qū)商都、察右前旗和赤峰地區(qū)林西等地也均有發(fā)生。該未知的苗期病害會給甜菜的生產(chǎn)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。糖廠技術(shù)人員認(rèn)為是苗期褐斑病，筆者初步認(rèn)為是真菌病害但不一定是褐斑病菌所致。因此，有必要通過室內(nèi)柯赫氏法則試驗(yàn)盡早診斷出該未知病害及鑒定其病原，為有效控制此類病害、減輕甜菜損失提供理論指導(dǎo)。

圖1 苗期甜菜未知葉斑病害葉片癥狀

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜菜：采自內(nèi)蒙古林西地區(qū)和河北省張北縣地區(qū)未知病害的苗期甜菜。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），用于病原菌的分離、培養(yǎng)、保存[2]。

1.2 方法

1.2.1 未知病原分離與保存及病原鑒定 在采自我國不同地點(diǎn)甜菜病葉的病健交界處取5 mm×5 mm的病組織，3%次氯酸鈉消毒3～5 min，無菌水沖洗3次后晾干接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)并純化，將純化后的病原物置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。主要依?jù)形態(tài)和分子序列進(jìn)行鑒定。DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序等參照林杰等方法[2-6]。

1.2.2 接種實(shí)驗(yàn) 采用無傷接種的葉片涂抹法進(jìn)行致病性試驗(yàn)，供試甜菜品種甜研309。方法如下：1）每株菌需要品種為甜研309健康生長3～4周的葉片15片，置于發(fā)芽盒中（每盒5片葉子），事先在發(fā)芽盒內(nèi)墊上合適大小的滅菌濾紙，并噴灑足量滅菌水用于保濕；2）在每個葉片上下兩端均接種20μL濃度為106個/mL孢子懸浮液（接種處要遠(yuǎn)離葉脈），同時(shí)設(shè)置無菌水處理的葉片作為對照；3）接種完畢用保鮮膜將發(fā)芽盒封好，再放入25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，7 d后觀察葉片的發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)果[2]。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 直接提取甜菜病葉DNA進(jìn)行PCR檢測結(jié)果

分別提取甜菜病葉DNA直接PCR檢測結(jié)果，檢測結(jié)果表明甜菜褐斑病菌的特異引物不能擴(kuò)增出特異條帶，而用真菌檢測通用ITS引物可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖2）?；诖藱z測結(jié)果可知：該苗期病害并非甜菜褐斑病，可以初步確定是一種真菌病害。

2.2 病原菌分離結(jié)果

取甜菜病健交界處組織進(jìn)行分離，并逐步純化獲得純培養(yǎng)物（3次重復(fù)以上），5個分離物（林西、張北）在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)菌呈灰色毛絨狀均勻分布（圖3和4）。

圖2 不同引物PCR檢測病樣品結(jié)果

圖3 林西病樣分離的病原菌菌落正反面

圖4 張北病樣分離的病原菌菌落正反面

2.3 提取分離菌株菌絲的DNA檢測結(jié)果

2.3.1 利用真菌檢測通用引物ITS1及ITS4的檢測結(jié)果 刮取上述5個分離物（L1、L2、Z1、Z2、Z3）菌絲提取DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4檢測，PCR檢測結(jié)果得到一條長541 bp單一條帶（圖5）。

經(jīng)過對5個分離物擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接轉(zhuǎn)化，各挑取8個克隆，測序結(jié)果比對序列相同。NCBI比對結(jié)果為：無論是直接提取病葉DNA測序還是分離的病原菌提取菌落DNA測序得到的序列相同，比對結(jié)果為Alternaria tenuissima（極細(xì)鏈格孢菌）。

2.3.2 利用H3-1a/H3-1b引物檢測 利用組蛋白3基因部分編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)的引物H3-1a和H3-1b擴(kuò)增分離物菌絲DNA結(jié)果得到一條600 bp左右單一條帶。對照為一株已經(jīng)鑒定的鏈格孢菌?；厥諟y序結(jié)果同真菌通用引物檢測結(jié)果一致，均為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima），見圖6。

圖5 真菌通用引物ITS1及ITS4 PCR檢測分離菌株結(jié)果L：代表內(nèi)蒙林西分離物；Z：代表河北張北分離物

圖6 H3-1a/H3-1b引物PCR檢測結(jié)果

2.4 分離物回接試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)柯赫氏法則，將分離得到的病原物回接到苗期甜菜葉片上，出現(xiàn)了相同的癥狀，接種成功率為100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致，表明分離的菌株確實(shí)是引起這種病害的病原物（圖7）。將回接成功的甜菜病葉，取病健交界處組織進(jìn)行分離、鑒定，同樣再次獲得了該病原菌，完成了柯赫氏法則全部試驗(yàn)（圖8）。

圖7 病原菌回接甜菜（品種為甜研309）

圖8 從接種發(fā)病葉片再分離病原菌

3 結(jié)論與討論

通過對張北和林西甜菜苗期發(fā)生未知葉部病害樣品進(jìn)行病葉提取DNA直接PCR檢測、病原菌分離、鑒定和回接試驗(yàn)，進(jìn)行了準(zhǔn)確診斷和鑒定。提取甜菜苗期葉部病害樣和分離的病原菌株菌絲DNA，利用真菌檢測的通用引物ITS1及ITS4和根據(jù)組蛋白3基因部分編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)的H3-1a和H3-1b引物檢測結(jié)果得到一條單一條帶，測定序列，NCBI比對結(jié)果表明，無論是直接提取病葉DNA測序還是分離的病原菌提取菌落DNA測序得到的序列相同，結(jié)合分離菌落形態(tài)，對該病害的病原菌進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)進(jìn)行病原菌回接實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)能引起甜菜苗期葉斑病害。首次明確了這種甜菜苗期出現(xiàn)的未知葉斑病害為一種真菌病害，其病原為極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima），排除了褐斑病菌危害的可能性，解決了生產(chǎn)中的難題，為今后再出現(xiàn)此種病害的診斷和尋求有效控制措施提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

極細(xì)鏈格孢菌是一種重要的植物病原真菌，其對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，寄主范圍廣泛[7]，不僅能侵染柚、柑橘、杏、葡萄、臍橙、檸檬、草莓等水果，還可在花生、小麥、向日葵、棉花、大豆、辣椒、豇豆及綠穗莧等多種植物上寄生，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[8]。2014年黑龍江大學(xué)在紅柴胡（一種雜草）上報(bào)道過極細(xì)鏈格孢菌類似序列。由于我們采集的樣品有限，因此，不排除有其他鏈格飽菌種類可以引起此病的可能性。

我們在調(diào)查時(shí)初步診斷為真菌病害，并給出了初步防治建議。對于發(fā)生較重的苗床可以用防治褐斑病的廣譜性藥劑苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑等進(jìn)行噴藥控制。如果苗源緊張，新葉和根發(fā)育正常的苗子可以移栽。極細(xì)鏈格孢菌通過我們的準(zhǔn)確診斷和病原鑒定，可以更有針對性地進(jìn)行病害發(fā)生分布、發(fā)生因素分析和有效控制技術(shù)研發(fā)。

致謝：博天糖業(yè)股份有限公司張海和高鴻斌先生，荷蘭安地公司北京代表處的秦樹才先生等協(xié)助采集甜菜樣品；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院張惠忠研究員提供甜菜品種。