李英紅　陳皓　劉欣然　陳玉玲 魏堰翀 肖港平 賈永森

【摘 要】 目的：觀察加味通幽湯對(duì)缺氧導(dǎo)致的食管癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)（VM）形態(tài)學(xué)和細(xì)胞增殖的影響。方法：缺氧環(huán)境培養(yǎng)Eca109細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞VM，以加味通幽湯含藥大鼠血清干預(yù)細(xì)胞，觀察其對(duì)VM形態(tài)的影響，CCK8法檢測(cè)方藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：常氧對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)成團(tuán)狀且無(wú)規(guī)律；含藥血清常氧組細(xì)胞分散，出現(xiàn)凋亡；缺氧對(duì)照組細(xì)胞相互連接呈管狀；含藥血清治療組細(xì)胞成團(tuán)塊狀并且出現(xiàn)凋亡。CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，含藥血清治療組明顯低于其他3組（P=0.000）。結(jié)論：加味通幽湯可改善食管癌細(xì)胞VM形態(tài)變化，并抑制缺氧環(huán)境下的細(xì)胞增殖。

【關(guān)鍵詞】 食管癌；Eca109細(xì)胞；加味通幽湯；血管生成擬態(tài)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）08-0023-04

Abstract：Objective To observe effectof Modified Tongyou Decoction （MTD） onvasculogenic mimicry （VM） morphology and cell proliferation of esophageal squamous carcinoma cellunder hypoxic conditions.Methods Eca109 cells were cultured in hypoxia environment， vasculogenic mimicry was observed through microscope. Rats serum with MTDwas taken into culture medium， VMmorphology was observed and cell proliferation was determined with CCK8 assay.Results Cells in the controlled group shape of cells were colony and irregular； cells were scatteredin the medicated-serumcontrolled group， apoptosis emerging； however， cells were connected with each other in hypoxia group cell with fusion of tubulous structure； cells in the medicated-serum treatment group were mass clumps and apoptosis also occurred. Proliferation ratio in the medicated serum treatment group was significantly lower than that in the other 3 groups（P=0.000）.Conclusion Under hypoxia conditions，MTD shows significant effect on VM andproliferationof Eca109 cells .

Keywords：Esophageal Cancer； Eca109 cell； Modified Tongyou Decoction； Vasculogenic Mimicry

在世界范圍內(nèi)，我國(guó)的食管癌發(fā)病率和死亡率均位居各國(guó)之首。我國(guó)的食管癌病理類(lèi)型以鱗癌為主，約占食管癌總數(shù)的95%左右。食管鱗癌具有進(jìn)展迅速、早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，絕大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較多，總體預(yù)后較差，嚴(yán)重危害人們健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry， VM），血管生成擬態(tài)是對(duì)傳統(tǒng)腫瘤血管生成理論的補(bǔ)充。腫瘤增生過(guò)快造成腫瘤微環(huán)境始終處于相對(duì)缺氧和代謝紊亂狀態(tài)，這是惡性腫瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn)之一。研究表明缺氧可觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列應(yīng)激性保護(hù)反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞在沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞的參與下，表型出現(xiàn)轉(zhuǎn)化，通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑直接形成特有的微循環(huán)管道，這種管道能夠執(zhí)行微血管功能，部分彌補(bǔ)了因?yàn)檠苄律鷾笥诹鲶w生長(zhǎng)所造成的氧和營(yíng)養(yǎng)供給的缺乏，促進(jìn)腫瘤迅速增長(zhǎng)[4-7]。

食管癌在中醫(yī)屬于“噎膈”范疇，“金元四大家”之一李東垣所著《蘭室秘藏》記載有“通幽湯”，是治療瘀血內(nèi)結(jié)，濁氣不降之噎膈[8]的代表方，筆者結(jié)合中藥藥理研究成果[9-14]，創(chuàng)制加味通幽湯，獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（ZL201110308544.0），全方由桃仁、紅花、升麻、檳榔、半枝蓮和白花蛇舌草6味中藥組成。方中活血化瘀藥桃仁、紅花與行氣散結(jié)藥升麻、檳榔抑瘤效果顯著；半枝蓮、白花蛇舌草中含有的黃酮類(lèi)、總多糖、皂苷等具有顯著的抑瘤和促凋亡作用，臨床廣泛應(yīng)用于包括食管癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤。本研究觀察了加味通幽湯對(duì)缺氧條件下食管癌Eca109細(xì)胞VM形態(tài)和細(xì)胞增殖的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 4～6周齡SD雄性大鼠，體重200～400 g，清潔級(jí)，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK-（軍）2014-0001。人食管癌 Eca109 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.2 藥物與試劑 加味通幽湯（桃仁5 g，紅花15 g，升麻10 g，檳榔5 g，半枝蓮15 g，白花蛇舌草15 g），各單味藥物均購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店。

新生牛血清（GIBCO公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），1640培養(yǎng)基（CORNING公司），PBS緩沖液（BI公司），10%水合氯醛，Matrigel膠，CCK8（Amersco公司），10×CoCl2（Sigma公司），Milli-Q水（Milli-pore公司Milli-Q超純水設(shè)備生產(chǎn)）。

1.3 儀器與材料 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）； 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）； 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司）； 移液管（gibcol公司）； 離心管（gibcol公司）； 3MK型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）； 1100型無(wú)菌超凈臺(tái)（美國(guó)Forma公司）； 3366型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma公司）； TMD-2倒置式顯微鏡（日本Nikon公司）； NOVAPATH 450型酶標(biāo)光度計(jì)（美國(guó)Bio-Tek公司）。

2 方 法

2.1 方藥制備 加味通幽湯加入30倍體積的水，浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮40 min，收集藥液，入燒杯中濃縮方藥至200 mL，-20℃凍存，用時(shí)調(diào)至所需濃度。

2.2 大鼠血清制備 4～6周齡SD大鼠40只，將其隨機(jī)分為兩組（對(duì)照組15只，含藥組25只），對(duì)照組和含藥組分別灌胃0.9%的生理鹽水和加味通幽湯。調(diào)整加味通幽湯濃度：以標(biāo)準(zhǔn)成人用量為基礎(chǔ)，按照大鼠體表面積與人體換算系數(shù)，計(jì)算大鼠所需生藥量（14.2mg/mL），以Milli-Q水調(diào)整藥液濃度。

兩組大鼠灌胃量均為1mL/d，連續(xù)灌胃14 d。最后1次灌胃后12h，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上層血清。將提取到的血清56℃恒溫水浴滅活加熱30 min后，在超凈臺(tái)中用針式濾器（0.22μm）過(guò)濾除菌，放入EP管中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及種板（96孔） 以含有10%的FBS和1%的雙抗1640培養(yǎng)基10 mL接種Eca109細(xì)胞于100 mm2培養(yǎng)皿中，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，PBS沖洗后用0.25%胰酶消化，離心反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度10000個(gè)/mL，每孔接種150μL的懸液，培養(yǎng)1 d。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 24孔板每孔加入300μL Matrigel膠（冰上操作），置于培養(yǎng)箱30min使其凝固，每孔給予1000μL各實(shí)驗(yàn)組單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1d。倒置顯微鏡（×200）下觀察拍攝細(xì)胞形態(tài)。

2.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取出96孔板，棄培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為A組（對(duì)照組）、B組（缺氧組）、C組（含藥血清對(duì)照組）、D組（含藥血清治療組）。A組： 10%對(duì)照大鼠血清、90%1640空白培養(yǎng)基；B組： 10%對(duì)照大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導(dǎo)液和80%1640空白培養(yǎng)基；C組：10%含藥大鼠血清、90%1640空白培養(yǎng)基；D組：10%含藥大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧誘導(dǎo)液和80%1640空白培養(yǎng)基。每孔分別加入各組所需培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1d后，每孔加入10μL的CCK8，培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)OD值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差別顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 加味通幽湯對(duì)細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響 4組培養(yǎng)24 h后形態(tài)發(fā)生明顯變化。鏡下觀察，對(duì)照組Eca109細(xì)胞成團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，無(wú)明顯規(guī)律。缺氧組細(xì)胞則相互連接，成單條或多條管狀結(jié)構(gòu)。在給藥后細(xì)胞都發(fā)生了凋亡。含藥血清對(duì)照組細(xì)胞分散無(wú)規(guī)律，而含藥血清治療組細(xì)胞聚集成團(tuán)狀或條索狀沒(méi)有出現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)。如圖1所示。

3.2 加味通幽湯對(duì)缺氧條件下細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)給予加味通幽湯刺激后，各組間Eca109細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯差異（如圖2所示）。與對(duì)照組相比，Eca109細(xì)胞給予CoCl2處理后，細(xì)胞活性明顯降低，此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。Eca109細(xì)胞給予含藥血清處理后與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性無(wú)明顯變化（P=0.867）。然而，CoCl2刺激Eca109細(xì)胞后給予含藥血清治療，細(xì)胞活性與含藥血清對(duì)照組和缺氧組相比，細(xì)胞活性均有所下降，此差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。提示加味通幽湯進(jìn)一步抑制缺氧誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞活性。

4 討論

食管癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)是其高發(fā)區(qū)[15]，約占全球的50%，同時(shí)也是死亡率最高的國(guó)家[16]。中醫(yī)理論認(rèn)為其重要病機(jī)是內(nèi)傷飲食、情志不遂互為因果[17]。陳無(wú)擇在《三因極一病證方論·卷八》中指出：“喜怒不常，憂思過(guò)度，恐慮無(wú)時(shí)，郁而生涎，涎與氣搏，升而不降，逆害氣滯……與五膈同，但此在咽嗌，故名五噎”，說(shuō)明憂思郁怒導(dǎo)致氣機(jī)郁滯，氣滯或津停生痰，或瘀血內(nèi)生，交阻于食道，妨礙飲食。古今醫(yī)家認(rèn)為惡性腫瘤患者體內(nèi)血行不暢、瘀血內(nèi)停，現(xiàn)代臨床也證實(shí)了血瘀是腫瘤形成發(fā)展的主要病理機(jī)制。故治療當(dāng)以活血祛瘀、行氣散結(jié)。本實(shí)驗(yàn)所使用的加味通幽湯由白花蛇舌草、半支蓮、升麻、檳榔、桃仁、紅花組成，其中桃仁、紅花活血祛瘀；半支蓮、白花蛇舌草可解除體內(nèi)之瘀毒；檳榔下行而破氣滯，升麻升清而降濁陰，一升一降，胃氣乃通。全方緊扣食管癌的病機(jī)，以行氣、活血、祛瘀、滋養(yǎng)陰血為主要功效。

惡性腫瘤的存活和生長(zhǎng)離不開(kāi)血液供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞可以在缺氧情況下模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞形成一種功能上類(lèi)似于正常血管的通道，形成另一種腫瘤供血系統(tǒng)，這種血供不需要內(nèi)皮細(xì)胞的參與，但其內(nèi)部含有紅細(xì)胞和血漿，并且還可以與常規(guī)的內(nèi)皮血管相溝通，構(gòu)成血液輸送網(wǎng)絡(luò)，即血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重要的作用，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。惡性程度高的腫瘤才能形成VM，而低度的惡性腫瘤不能形成，這是因?yàn)閻盒猿潭雀叩哪[瘤生長(zhǎng)迅速，更容易形成缺氧的微環(huán)境；另一方面惡性濃度高的腫瘤分化差，腫瘤細(xì)胞的多能性高，遂能夠模擬內(nèi)皮細(xì)胞并具備相應(yīng)的功能。由于VM的結(jié)構(gòu)特殊，使腫瘤細(xì)胞與血流之間的屏障減弱，容易脫落隨血液運(yùn)輸而轉(zhuǎn)移，從而增高了癌轉(zhuǎn)移的幾率。

本實(shí)驗(yàn)VM形態(tài)學(xué)觀察顯示，對(duì)照組Eca109細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集生長(zhǎng)，給藥后的含藥血清對(duì)照組使細(xì)胞分散并出現(xiàn)凋亡。在給予缺氧誘導(dǎo)后，細(xì)胞惡性程度加重，形成了VM管道以獲得足夠的氧氣。含藥血清治療組的細(xì)胞雖呈現(xiàn)團(tuán)塊聚集生長(zhǎng)但是未出現(xiàn)VM，并且呈現(xiàn)不同程度的凋亡。說(shuō)明加味通幽湯對(duì)Eca109細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成起到了顯著的抑制作用。

惡性增殖是腫瘤細(xì)胞最主要的特征，不斷增多的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致耗氧量增加，造成腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境，促進(jìn)VM形成，增加細(xì)胞氧供，從而形成“細(xì)胞增殖-缺氧-VM-再增殖”的循環(huán)，而未發(fā)生VM的區(qū)域常伴隨細(xì)胞缺氧凋亡。本研究CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和含藥血清對(duì)照組細(xì)胞活性無(wú)差異，缺氧組和含藥血清治療組細(xì)胞活性明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，提示缺氧導(dǎo)致細(xì)胞活性降低；另外，含藥血清治療組細(xì)胞增殖低于缺氧組，說(shuō)明缺氧的Eca109細(xì)胞對(duì)加味通幽湯更敏感，加味通幽湯進(jìn)一步抑制缺氧組細(xì)胞活性，影響其形成VM。

本研究表明加味通幽湯對(duì)食管癌的Eca109細(xì)胞VM形成有顯著抑制作用，對(duì)Eca109細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，但臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-02-05 編輯：劉 斌）