田洪星 繆艷燕 黃麗娟

【摘 要】 目的： 建立淫羊藿破壁飲片薄層鑒別方法。方法：采用TLC法對淫羊藿破壁飲片中淫羊藿苷進(jìn)行薄層鑒別。結(jié)果：該鑒別方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡便可行。結(jié)論：為完善淫羊藿破壁飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 淫羊藿破壁飲片；淫羊藿苷；薄層鑒別；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）04-0020-05

Abstract：Objective To set up the TLC identification of the Ultrafine Granular Powder of Epimedium with Epimedium glycoside as standard compound. Method Identification of the Epimedium glycoside of the Ultrafine Granular Powder of Epimedium by TLC. Results The established TLC identification of V the Ultrafine Granular Powder of Epimedium is specific，repeatable and simple. Conclusion It will provide the reference，which can improve the quality standardization of Ultrafine Granular Powder of Epimedium.

Keywords：Ultrafine Granular powder of Epimedium； Epimedium glycoside ； TLC； Quality Standard

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicomu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc. ） Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉，是我國常用中藥之一，主要用于治療腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣等癥[1]。現(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿對免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腫瘤等均有一定的作用[2]。當(dāng)前，尚沒有對淫羊藿破壁飲片薄層鑒別進(jìn)行系統(tǒng)的文獻(xiàn)研究，因此，為了能更好地控制其質(zhì)量，確保其臨床應(yīng)用的安全性和有效性，筆者以淫羊藿苷作為對照品，從提取方法、展開系統(tǒng)、顯色方法等方面對淫羊藿破壁飲片的薄層鑒別方法進(jìn)行了探索，以期擬定出淫羊藿破壁飲片的薄層鑒別方法，進(jìn)而完善淫羊藿破壁飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；ATY224型電子分析天平（Shimadzu cororation）；ZF-1型三用紫外儀（邦西儀器科技有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），微量進(jìn)樣器（20 μL）。

1.2 材料 淫羊藿破壁飲片（批號：20171001，20171002，20171003，20171004，20171005自制）、淫羊藿（經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院徐劍教授鑒定為藥典上收載的淫羊藿，相關(guān)信息見表1），淫羊藿對照藥材（批號：121632-201502，中國食品藥品檢定研究院）、淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，中國食品藥品檢定研究院）；無水氯化鋁（批號：20170201，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、硫酸（批號：20170301，重慶川東化工有限公司）、乙酸乙酯（批號：1601101，上海申博化工有限公司）、丁酮（批號：20160826，天津科密歐有限公司）、甲酸（批號：2060625，天津科密歐有限公司）、磷酸（批號：20160401，重慶川東化工有限公司）、醋酸（批號：1703101，上海申博化工有限公司）、氯仿（批號：20170301，西隴科學(xué)有限公司）、無水乙醇（批號：20170201，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等均為分析純。

硅膠H板（規(guī)格：100 mm×100 mm，批號：20150917，青島海洋化工廠）、硅膠H板（規(guī)格：50 mm×100 mm，批號：20150917，青島海洋化工廠）；硅膠G板（規(guī)格：100 mm×100 mm，批號：20160321，青島海洋化工廠）、硅膠G板（規(guī)格：50 mm×100 mm，批號：20160321，青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法的考察 分別稱取本品0.5 g，參考相關(guān)文獻(xiàn)[1，3-5]，按下述方法處理：①加乙醇10 mL，溫浸30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖糽 mL使溶解，作為供試品溶液；②加乙醇10 mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；③加70%乙醇10 mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；④加50%乙醇10 mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；⑤加石油醚（30～60℃）20 mL回流提取30min，濾過，揮去石油醚，殘?jiān)右掖?0超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖糽 mL使溶解，作為供試品溶液；⑥加熱水10 mL，超聲30min，濾過，濾液用乙酸乙酯萃取兩次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)鼩堅(jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；⑦加乙醇10 mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0溶解，石油醚洗滌，每次10 mL，水液層用乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.099 mg/mL的溶液，即得對照溶液。取上述各供試品溶液、對照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（3∶6∶5∶1∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試驗(yàn)，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖1。研究顯示方法①、②和⑤斑點(diǎn)不清晰，且方法①存在嚴(yán)重拖尾，斑點(diǎn)未分開等現(xiàn)象，方法③和④則比方法①、②、⑤、⑥和⑦斑點(diǎn)都較清晰且分離效果較好，原因可能是當(dāng)淫羊藿采取單獨(dú)的乙醇提取時(shí)，所提取出來的成分較多，干擾因素較大，故出現(xiàn)拖尾或分不開的現(xiàn)象，當(dāng)增加石油醚去色或除雜時(shí)，也帶走了部分目標(biāo)成分，薄層斑點(diǎn)顯色就不是很明顯，而方法③和④則采取一定比例的乙醇既最大化提取出目標(biāo)成分，又通過后續(xù)的水溶解乙酸乙酯萃取，除去多糖等雜質(zhì)成分，使得雜質(zhì)成分較少，斑點(diǎn)顯色清晰，另外，文獻(xiàn)研究表明方法④所提取出來的淫羊藿苷成分較高[6]，故選取方法④為淫羊藿破壁飲片鑒別的提取方法。

2.2 展開系統(tǒng)的考察 取淫羊藿破壁飲片按提取方法④分別制成供試品溶液。取供試品溶液和對照品溶液各10μL，點(diǎn)于薄層板上，參考相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)之上[7-8]，分別在下述各展開系統(tǒng)中展開：①乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）；②甲醇-丁酮-三氯甲烷-水（4∶6∶6∶1）；③氯仿-甲醇-丁酮（1∶2∶2）；④氯仿-甲醇-水（13.5∶6∶2）靜置至澄清的下層溶液；⑤甲醇-丁酮-氯仿-水（3∶6∶5∶1）；⑥甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（3∶6∶5∶1∶0.2）。結(jié)果見圖2。研究顯示展開系統(tǒng)⑥展開的薄層板斑點(diǎn)清晰，且分離顯色效果最好，因此選擇展開系統(tǒng)⑥作為展開條件。

2.3 顯色方法的考察 取淫羊藿破壁飲片按照2.1項(xiàng)下提取方法④制成供試品溶液，再按照2.2項(xiàng)下展開系統(tǒng)⑥展開，然后分別噴上以下三種顯色試液進(jìn)行考察，再置紫外光燈（365 nm）下檢視：①三氯化鋁試液；②5%三氯化鐵乙醇溶液；③5%硫酸乙醇溶液。結(jié)果見圖3。研究顯示三種顯色方法都有較好的顯色效果，但方法①顯色斑點(diǎn)最為明亮，且清晰易見，因此選擇顯色方法①作為顯色方法。

2.4 點(diǎn)樣量的考察 取淫羊藿破壁飲片按2.1項(xiàng)下提取方法④制備供試品溶液，然后按2.2項(xiàng)下展開系統(tǒng)⑥展開，2.3項(xiàng)下顯色方法①顯色，考察點(diǎn)樣量（2、6、8、10、14、18μL）對淫羊藿破壁飲片薄層斑點(diǎn)顯色效果的影響，結(jié)果見圖4。研究顯示，當(dāng)樣品點(diǎn)樣量為2μL時(shí)，由于濃度過低，斑點(diǎn)能見但不清晰，而當(dāng)點(diǎn)樣量為6～10μL時(shí)，斑點(diǎn)比較清晰，增大到14、18μL時(shí)，由于濃度增大，產(chǎn)生了拖尾現(xiàn)象，因此，選擇6～10μL作為點(diǎn)樣量。

2.5 預(yù)飽和時(shí)間的考察 干燥薄層板和展開劑蒸汽間的平衡主要表現(xiàn)在從展開開始至結(jié)束過程中薄層對展開劑蒸汽的預(yù)吸附，而薄層各個(gè)部分項(xiàng)吸附的程度是不同的。當(dāng)用多元展開劑時(shí)，又將發(fā)生選擇性吸附現(xiàn)象，這些都會影響色譜分離。因此在用多元展開劑時(shí)，經(jīng)常將薄層及展開室進(jìn)行預(yù)飽和，以便得到重現(xiàn)的薄層色譜圖。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了不同預(yù)飽和時(shí)間（15、20、25、30 min）對淫羊藿破壁飲片薄層斑點(diǎn)顯色效果的影響。結(jié)果顯示，預(yù)飽和時(shí)間在15～30 min時(shí)，對淫羊藿破壁飲片薄層色譜顯色效果影響不明顯，顯色效果均較好、斑點(diǎn)清晰可見，且邊緣效應(yīng)較小，因此，選擇預(yù)飽和時(shí)間15 min即可。

2.6 耐用性考察

2.6.1 薄層板的考察 為考察薄層板對淫羊藿破壁飲片薄層色譜斑點(diǎn)的影響，分別對不同規(guī)格的硅膠H板（100 mm×100 mm，50 mm×100 mm）、硅膠G板（100 mm×100 mm，50 mm×100 mm），進(jìn)行考察，結(jié)果見圖5，研究顯示，硅膠H板薄層斑點(diǎn)顯示效果整體上比G板好，且硅膠G板薄層斑點(diǎn)上端均存在一定的邊緣效應(yīng)，因此，選擇硅膠H板作為薄層板。

2.6.2 溫度的考察 為考察不同溫度對淫羊藿破壁飲片薄層色譜斑點(diǎn)的影響，分別考察了不同溫度（2、10、20、30、35、40℃）對淫羊藿破壁飲片薄層色譜斑點(diǎn)的影響。結(jié)果顯示，展開環(huán)境溫度在10℃～30℃時(shí)，顯色效果分離度均較好、斑點(diǎn)清晰可見，沒有明顯的差異。當(dāng)?shù)陀?℃，由于展開劑溫度過低，導(dǎo)致展開時(shí)間過長，效率較低，當(dāng)高于40℃時(shí)，部分易揮發(fā)的展開劑出現(xiàn)了揮發(fā)的現(xiàn)象，導(dǎo)致展開系統(tǒng)中內(nèi)部環(huán)境存在極性分布不均勻或不等的現(xiàn)象，導(dǎo)致薄層斑點(diǎn)不清晰以及拖尾和邊緣效應(yīng)等現(xiàn)象，因此，溫度應(yīng)控制在10～35℃。

2.6.3 相對濕度的考察 薄層板在存放或活化后在點(diǎn)樣過程中，吸附劑表面能可逆地吸收水分，如空氣濕度過大，薄層活度會降低，影響分離效果，因此，本研究考察了相對濕度（32%、42%、58%、65%、72%、88%）對淫羊藿破壁飲片薄層色譜顯色效果的影響。結(jié)果顯示，相對濕度高于72%以上時(shí)，由于薄層板過多吸收水分，斑點(diǎn)拖尾，對照品與樣品斑點(diǎn)不在同一位置，不能有效地進(jìn)行鑒別，而相對濕度在32%～72%時(shí)，斑點(diǎn)清晰，分離度較好，對照品與樣品斑點(diǎn)在同一位置，能有效地進(jìn)行鑒別，因此相對濕度應(yīng)控制在32%～72%。

2.7 淫羊藿破壁飲片薄層鑒別 取本品0.5 g（5批樣品，批號見表1），精密稱定，置錐形瓶中，加50%乙醇10 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.099 mg/mL的溶液，即得對照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液6～10 μL和0.099 mg/mL淫羊藿苷對照品溶液10 μL，分別點(diǎn)與同一塊硅膠H板上，以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（3∶6∶5∶1∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干噴以三氯化鋁試液，再置紫外光燈（365 nm） 下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)。5批樣品均能鑒別出淫羊藿苷，且斑點(diǎn)清晰可見，結(jié)果見圖6。

3 討論

淫羊藿作為我國常用中藥之一，《中國藥典》2015年版一部淫羊藿項(xiàng)下已有以淫羊藿苷為對照品建立的薄層色譜鑒別方法，然而，經(jīng)筆者多次驗(yàn)證，采用藥典展開系統(tǒng)及提取方法所做的薄層鑒別圖，顯色效果不佳，存在一定拖尾、擴(kuò)散、邊緣效應(yīng)等現(xiàn)象，且重復(fù)性不佳。因此，筆者從提取方法、展開系統(tǒng)、顯色方法等方面對淫羊藿破壁飲片的薄層鑒別進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，最終優(yōu)選出文中的薄層鑒別方法，該方法簡便、可行、斑點(diǎn)清晰，易于檢出，且分離效果較藥典方法好，專屬性強(qiáng)，為更好地控制淫羊藿破壁飲片質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

在預(yù)試和正式實(shí)驗(yàn)中，樣品溶液的提取分別考察了提取溶劑（水、乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙酸乙酯等）、提取方法（溫浸、回流、超聲）、提取時(shí)間（15、30、45 min），結(jié)果顯示，50%乙醇超聲30 min，然后采用乙酸乙酯萃取處理的提取的樣品溶液所做的薄層斑點(diǎn)清晰可見，分離度好，斑點(diǎn)較多；展開系統(tǒng)分別考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）、甲醇-丁酮-三氯甲烷-水（4∶6∶6∶1）、氯仿-甲醇-丁酮（1∶2∶2）、氯仿-甲醇-水（13.5∶6∶2）靜置至澄清的下層溶液、甲醇-丁酮-氯仿-水（3∶6∶5∶1）、甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（3∶6∶5∶1∶0.2）等，研究顯示，甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸（3∶6∶5∶1∶0.2）展開系統(tǒng)比較佳，其斑點(diǎn)清晰可見，分離度好，斑點(diǎn)較多，邊緣效應(yīng)較小等；顯色方法考察了三氯化鋁試液、5%三氯化鐵乙醇溶液、5%硫酸乙醇溶液三種，結(jié)果三氯化鋁試液斑點(diǎn)顯色最為清晰可見；考察點(diǎn)樣量時(shí)，最終選擇6～10 μL的點(diǎn)樣量，過低多高均會影響其顯色效果；耐用性試驗(yàn)中分別考察了溫度、濕度、薄層板對薄層斑點(diǎn)顯色效果的影響，結(jié)果顯示，本文中所摸索出來的薄層方法在一定的條件下，適用性較好。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：327-328.

[2] 劉凱杰， 李超.淫羊藿藥理研究進(jìn)展（綜述）[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2014，43（2）：183- 186.

[3]李德勛. 壯骨關(guān)節(jié)丸中淫羊藿、骨碎補(bǔ)的薄層色譜鑒別[J]. 中成藥， 2003， 25（8）：682-683.

[4] 阮桂平， RUANGui-ping. 仙珍骨寶膠囊中淫羊藿苷薄層色譜鑒別方法的篩選[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2006， 17（6）：1020-1021.

[5] 朱潔， 肖海濤， 郝小燕，等. 天參益智膠囊中四味藥材的薄層色譜鑒別及淫羊藿苷的含量測定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2008， 19（2）：324-326.

[6] 楊柳， 鐘靜嫻， 林巧玲，等. 淫羊藿中淫羊藿苷的提取工藝研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2005， 16（4）：286-287.

[7]王繼玉， 卑國斌. 改進(jìn)補(bǔ)腎強(qiáng)身片淫羊藿苷薄層色譜鑒別方法的建議[J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2010（s1）：207-208.

[8] 麥少霞. 更年滋腎口服液的薄層鑒別[J]. 中藥材， 2009， 32（8）：1313-1314.