李璐璐，陳玉梅，羅 瓊，李惠敏，秦新民

(廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541004)

乙烯是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的氣體激素[1]，它參與花的發(fā)育、促進果實的成熟、組織的衰老和各種脅迫反應等生理活動，可在自身發(fā)育以及各種環(huán)境因子所誘導下產(chǎn)生。茄科植物中,乙烯對花發(fā)育的調(diào)控受到乙烯合成關鍵酶基因影響[2]。而乙烯應答因子(ethylene response factor, ERF)是植物中存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，對植物生長發(fā)育過程中面臨到的一些脅迫應答起著重要的作用[3-4]。雷明等[5]證明了ERF轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯調(diào)控路徑，促進蜻蜓鳳梨花柄的發(fā)育。王萱[6]發(fā)現(xiàn)柑橘乙烯誘導酯酶基因可被乙烯和傷害處理誘導而大量表達，在柑橘抗逆反應中起重要作用。其機理為植物細胞的乙烯受體蛋白與植物體產(chǎn)生的乙烯結(jié)合誘導促EIN3/EIL1基因的表達，從而促發(fā)乙烯的下游反應，EIN3基因編碼蛋白則通過結(jié)合到ERF基因的啟動子區(qū)，調(diào)控后者的表達，使得植物體產(chǎn)生應答響應。其中，EIN3基因的高表達及其蛋白的積累在植物雌配子發(fā)育中有重要作用[7]。

沙田柚屬蕓香科柑桔屬，在我國廣東、廣西的栽培面積較大。沙田柚具有配子體自交不親和性，在自然授粉情況下坐果率極低，生產(chǎn)中必須進行人工授粉，較費時費力，不利于生產(chǎn)。植物自交不親和性是指植物不能正常地完成受精作用過程，主要表現(xiàn)在雄株產(chǎn)生的花藥不能與雌株的柱頭特意進行識別從而萌發(fā)，或者花藥可以正常萌發(fā)但是花粉管卻不能正常地生長，或者是花粉管可以正常生長，但是兩個配子不能完成精卵融合過程[8]。目前，沙田柚配子體自交不親和性的研究在細胞學和蛋白質(zhì)化學等方面取得了一定進展[9-14]，但尚未見乙烯應答因子基因與沙田柚自交不親和性相關的研究報道。本研究在對沙田柚自交和異交花柱進行轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上，獲得了沙田柚乙烯應答因子基因(Unigene16183_All)，并對該基因在未授粉、自花與異花授粉1～3 d花柱中的表達，以及其編碼蛋白質(zhì)的理化特征進行分析，旨在為深入研究乙烯應答因子基因的功能和沙田柚自交不親和的分子機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為沙田柚未授粉、自花與異花授粉花柱，處理與采集方法按文獻[15]的報道進行。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建庫和測序 按改良Trizol 法對總RNA進行提取[16]，轉(zhuǎn)錄組的建庫和測序參照文獻[15]。

1.2.2 序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建 乙烯應答因子基因序列和編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析分別采用DNAMAN、NetPhos 3.1 Server、SOPMA等軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學分析

基因(Unigene16183_All)序列全長為1013 bp (GenBank登錄號：MG905213)。通過生物信息學軟件DNAman以及NCBI網(wǎng)站上的NCBI ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對序列進行分析，該序列的開放閱讀框共有498 bp，編碼166個氨基酸(圖1)。

圖1 Unigene16183_All序列和推測氨基酸序列

2.2 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

運用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對該蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)的預測分析。結(jié)果顯示：該基因編碼的蛋白質(zhì)分子分子式為C800H1269N235O255S6，分子質(zhì)量為18.45 kDa，等電點PI為7.90。構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸中，蘇氨酸(Ser)所占比例最大，為14.5%，半胱氨酸(Cys)所占比例最少，僅為0.6%。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為72.06(>40)，屬于不穩(wěn)定蛋白。其中，該蛋白質(zhì)攜帶的負電荷氨基酸(Asp+Glu)與正電荷氨基酸(Arg+Lys)總數(shù)分別為19和20。利用DNAman軟件對該蛋白質(zhì)進行疏水性分析，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出該基因編碼的肽鏈中疏水性最大值約為2.14，位于第121位氨基酸，最小值約為-3.05，位于第14、15位氨基酸。該蛋白質(zhì)疏水性平均值為-0.561，鑒定該蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

圖2 Unigene16183_All蛋白疏水性分析

2.3 功能結(jié)構(gòu)域分析

將該基因編碼的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search進行鑒定，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有一個與AP2 superfamily蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，如圖3所示。

圖3 Unigene16183_All蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4 跨膜預測

運用TMHMM-2.0對該蛋白的跨膜區(qū)域進行預測。結(jié)果表明該蛋白質(zhì)位于膜外，不屬于跨膜蛋白，結(jié)果預測如圖4所示。

圖4 Unigene16183_All跨膜區(qū)預測

2.5 蛋白質(zhì)磷酸化位點預測

蛋白質(zhì)磷酸化位點采用在線預軟件NetPhos3.1Server進行預測。結(jié)果顯示，Unigene16183_All基因編碼的蛋白質(zhì)，共有24個可能的磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點共有18個，分別位于蛋白質(zhì)的第5、16、40、45、46、55、77、128、130、139、149、151、152、153、154、157、163和165位；蘇氨酸(Thr)磷酸化位點共5個，分別位于蛋白質(zhì)的第44、91、155、158和160位；酪氨酸(Tyr)磷酸化位點僅1個，為蛋白質(zhì)的第22位。可知此蛋白質(zhì)的磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，其次為蘇氨酸和酪氨酸。

2.6 蛋白質(zhì)二級以及三級結(jié)構(gòu)的預測

運用在線軟件SOPMA 對該基因編碼的蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)域的預測，結(jié)果表明，在該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋所占比例為30.72%，延伸鏈18.07%，無規(guī)則卷曲47.59%，β轉(zhuǎn)角占3.61%(圖5)。

h:α-螺旋；c:無規(guī)則卷曲；e:延伸；t: β折疊圖5 乙烯應答因子蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測

運用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對乙烯應答因子氨基酸序列三級結(jié)構(gòu)進行預測。結(jié)果表明：該基因編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)含有1個α-螺旋和2個β-折疊，螺旋和折疊之間由無規(guī)則卷曲連接(圖6)。

2.7 同源性分析

沙田柚乙烯應答因子基因編碼的氨基酸序列與其他13種植物乙烯應答基因編碼蛋白的同源性分析結(jié)果表明，沙田柚乙烯應答因子基因編碼的氨基酸序列與甜橙(Citrussinensis,XP-006467696.1)和克萊門柚(Citrusclementina,XM-006449381.1)的同源性分別為100%和98%。此外，DNAman構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明沙田柚乙烯應答基因編碼的蛋白質(zhì)與克萊門柚和甜橙有很近的親緣關系，屬于同一個進化分支(圖7)。

圖6 乙烯應答因子蛋白的三級結(jié)構(gòu)

Unigene16183_All(沙田柚，KU517851)，Citrussinensis(甜橙，XP_006467696.1)，Citrusclementina(克萊門柚，XM_006449381.1)，Heveabrasiliensis(橡膠樹，XP_021692420.1)，Ricinuscommunis(蓖麻,XP_002522517.1)，Vemiciafordii(光桐，APQ474444.1)，Vemiciamontana(皺桐，APQ47365.1),Medicagotruncatula(蒺藜苜蓿,XP_003593690.1),Phaseolusvulgaris(菜豆,XP_007148088.1)，Lycopersiconesculentum(番茄,AY192370.1)，Solanumtuberosum(馬鈴薯,JN125861.2),Malusdomestica(蘋果,GU732428.1)

圖7基于氨基酸序列的乙烯應答因子蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

AP2/ERF是轉(zhuǎn)錄因子基因家族中比例最大的一類轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和是否出現(xiàn)其他DNA結(jié)合域，劃分為AP2、ERF、RAV和soloist 4個家族[17-18]。其中AP2蛋白家族在調(diào)控植物花的發(fā)育過程中具有非常重要的功能，參與花分生組織的建立、花器官發(fā)育和果實成熟[19-22]。同時，AP2轉(zhuǎn)錄因子對種子和果實的發(fā)育也有重要的影響。其方式為通過對胚、胚乳和種皮發(fā)育的影響從而調(diào)控種子的大小[23-24]。Chung等[25]發(fā)現(xiàn)番茄SLAP2a基因在花和葉中不表達，而僅在其果實發(fā)育和成熟過程中表達，存在明顯的組織器官特異性。RNAi技術抑制番茄的SLAP2a基因表達的結(jié)果發(fā)現(xiàn)植株體內(nèi)的乙烯含量增加，而果實提前成熟。Bartley等[26]對番茄不同的成熟期AP2轉(zhuǎn)錄因子的表達進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在綠色果實、轉(zhuǎn)色期，以及紅色果實中均有表達，但轉(zhuǎn)色期的表達量最高。

通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守域預測和氨基酸序列同源性分析，沙田柚的乙烯應答因子基因編碼的蛋白質(zhì)含有一個AP2 superfamily蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與蕓香科的甜橙和克萊門柚的AP2蛋白相似性很高，相似度分別為100%和98%。表明了本研究所獲得的Unigene16183_All為沙田柚乙烯應答因子基因。

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)表明，沙田柚乙烯應答因子基因在自交和異交花柱中的轉(zhuǎn)錄水平存在差異。利用 RPKM(Reads Per Kb per Million reads)[27]對該基因在不同樣品中的表達進行分析，在未授粉花柱中的表達量為0.71，自交1 d的花柱中的表達量迅速上升(13.99)，自交2 d的表達量持續(xù)升高(31.08)，在自交3 d的表達量達到了最高(48.42)。 而在異交1 d的花柱中，該基因的表達快速升高(16.80)，異交2 d時持續(xù)升高(36.82)，但異交3 d的表達量則快速下降(18.98)。 以RPKM 值取2的對數(shù)值[log2(RPKM)] 對未授粉/自交1 d、未授粉/異交1 d、自交1 d/異交1 d花柱、自交2 d/異交2 d花柱和自交3 d/異交3 d花柱中該基因的表達水平進行統(tǒng)計，其log2(RPKM ratio)分別為 -4.30、-4.56、0.264、0.245、-1.35。以上數(shù)據(jù)表明，沙田柚AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子與授粉有關，無論是自交授粉或異交授粉，其表達出現(xiàn)急劇增加。鑒于目前尚未見AP2/ERF與植物授粉和自交不親和關系的研究報道，其在沙田柚自交不親和性反應中的作用機理有待深入研究。