曹學(xué)全 胡金蒙 楊朝暉 盧洪勝 魏科娜 章輝 顧華敏

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌居第2位，死亡率居第4位[1-2]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素、多種基因的聯(lián)合作用有關(guān)，其預(yù)后受多種因素影響，治療效果并不十分理想[3]。因此，尋找宮頸癌的特異性治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4（phosphatidylethanolamine binding protein 4，PEBP4）屬于PEBP家族的一個(gè)新成員，在細(xì)胞膜合成、成肌細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用[4]。有研究證實(shí)PEBP4表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥相關(guān)[5-6]。PEBP4過(guò)表達(dá)可增加肺癌細(xì)胞中蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化水平。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3kinase，PI3K）/Akt/mTOR信號(hào)軸可能是PEBP4促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵分子途徑[7]。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫組化En Vision法分別檢測(cè)48例宮頸癌和48例正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)差異，分析其表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系及宮頸癌組織中PEBP4和mTOR表達(dá)的相關(guān)性，初步從基因及蛋白水平探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2008年6月至2013年12月在本院手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本48例，患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療等，年齡 28～73（48.0±11.0）歲。參照 WHO宮頸癌組織學(xué)分類(lèi)（2003）進(jìn)行組織學(xué)分化程度的判斷。選取同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織標(biāo)本 48 例作為對(duì)照，患者年齡 32～61（44.5±6.7）歲。每例標(biāo)本的1/2在離體后20min內(nèi)放入-80℃低溫冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；另1/2以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，PIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料均購(gòu)于溫州長(zhǎng)豐生物科技公司。PEBP4山羊抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，mTOR兔抗人單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，En Vision通用試劑盒及DAB均購(gòu)自廣州基因公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平 設(shè)計(jì)PEBP4和mTOR基因PCR引物序列，具體如下：PEBP4 正 向 ：5′-ACTGGGTCTCATGATGGTGG-3′，反向：5′-CTCCATCCAGGAGGTGATCT-3′；mTOR 正向：5′-GCAGGAATAGCAAGAACTCG-3′，反向：5′-CCTCACAGCCACAGAAAGTAG-3′；內(nèi)參 GADPH正向：5′-GCTCACCATGGATGATGATATC-3′，反向：5′-GCCAGATTTTCTCCATGTCGTC-3′，所有引物均由溫州長(zhǎng)豐生物科技公司合成。-80℃低溫冰箱保存的標(biāo)本，冰上操作，提取總RNA并檢測(cè)純度，然后轉(zhuǎn)染成cDNA反應(yīng)體系，37℃孵育60min。采用SYBR Green熒光染料，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成40個(gè)PCR循環(huán)。產(chǎn)生的熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)表明PCR擴(kuò)增效率恒定，且已達(dá)到平臺(tái)期，引物特異性好且無(wú)引物二聚體產(chǎn)生。收集熒光信號(hào)進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平比較

1.4 免疫組化檢測(cè)PEBP4和mTOR蛋白表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10min，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min，分別加入一抗（PEBP4、mTOR抗體濃度分別為1:200和1:100）4℃過(guò)夜，再加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織作陽(yáng)性對(duì)照。PEBP4表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，mTOR表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒分布為陽(yáng)性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，觀察并記錄細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積為每例的最終積分。＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平比較 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表1。PEBP4、mTOR和GADPH的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 PEBP4、mTOR和GADPH的熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)（a：PEBP4熔解曲線(xiàn)；b：mTOR熔解曲線(xiàn)；c：GADPH熔解曲線(xiàn)；d：PEBP4擴(kuò)增曲線(xiàn)；e：mTOR 擴(kuò)增曲線(xiàn)；f：GADPH 擴(kuò)增曲線(xiàn)）

2.2 PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PEBP4 mRNA表達(dá)水平與宮頸癌浸潤(rùn)肌層、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者的年齡和分化程度均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。mTOR mRNA表達(dá)水平與宮頸癌患淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者的年齡、分化程度和浸潤(rùn)肌層均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)比較 PEBP4和mTOR蛋白在宮頸癌組織中呈強(qiáng)表達(dá)，而在正常宮頸組織中呈弱表達(dá)或陰性表達(dá)，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率分別為 72.92%（35/48）和 66.67%（32/48），明顯高于正常宮頸組織的 10.42%（5/48）和 8.33%（4/48），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.571和34.844，均P＜0.01）。

2.4 PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PEBP4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌浸潤(rùn)肌層、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡和宮頸癌分化程度均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡、宮頸癌分化程度和浸潤(rùn)肌層均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.5 宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.645，P=0.000）。48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)均陽(yáng)性30例，均陰性11例，宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.663，P=0.000），見(jiàn)表4。

表4 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

PEBP家族是由一類(lèi)具有與磷脂酰乙醇胺結(jié)合能力的堿性蛋白所組成，廣泛表達(dá)于多種植物和動(dòng)物。PEBP4是PEBP家族的一個(gè)新成員，該家族成員都有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域[8]。PEBP4在肌肉組織中有表達(dá)，在成肌細(xì)胞分化期間，PEBP4和Raff/MEK信號(hào)通路之間可相互調(diào)控。干擾PEBP4的表達(dá)可抑制成肌細(xì)胞分化，可能與Raff/MEK信號(hào)通路的激活有關(guān)。此外，PEBP4過(guò)表達(dá)引起Akt激活，同時(shí)抑制ERK/JNK的活性[7]。有研究表明PEBP4在多種腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)均增加，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明PEBP4在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中起著重要的作用[6-7,9]。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與低級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織比較，高級(jí)別膠質(zhì)瘤PEBP4表達(dá)明顯升高。多因素Cox回歸分析顯示PEBP4表達(dá)升高是膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨(dú)立因素。PEBP4低表達(dá)的患者較那些PEBP4高表達(dá)的患者有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。這些數(shù)據(jù)表明，PEBP4作為預(yù)測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤的分級(jí)和預(yù)后具有一定的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中PEBP4 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于正常宮頸組織，與Wu等[11]在胃癌中的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)隨著臨床分期進(jìn)展、浸潤(rùn)肌層加深和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，PEBP4 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PEBP4 mRNA和蛋白高表達(dá)者，宮頸癌臨床分期較高，較容易發(fā)生侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，沉默PEBP4的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移有明顯的抑制作用。此外，PEBP4過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和侵襲[11]。

mTOR是重要的絲氨酸/蘇氨酸蠶白激酶之一，是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。PI3K/Akt/mTOR通路是最重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路之一。通過(guò)影響其下游多個(gè)效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和代謝等一系列關(guān)鍵生理活動(dòng)[12]。近年來(lái)，在多種惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR途徑的異常活化，同時(shí)，該途徑的激活也可能在腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖和阻斷細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[13-14]。本研究顯示，mTOR mRNA和蛋白在正常宮頸組織均低表達(dá)，而在宮頸癌組織中表達(dá)明顯升高，并且隨著宮頸癌臨床分期進(jìn)展和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，表達(dá)水平進(jìn)一步提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示mTOR mRNA和蛋白高表達(dá)與宮頸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且患者臨床分期高，預(yù)后差。

Yu等[7]報(bào)道，PEBP4的過(guò)表達(dá)促進(jìn)Akt和mTOR的磷酸化，而沉默PEBP4的表達(dá)可抑制Akt和mTOR的磷酸化。因此，PEBP4可以通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑對(duì)肺癌細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究中Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平和蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)。提示PEBP4過(guò)表達(dá)可能通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR通路，導(dǎo)致mTOR mRNA和蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高，且均與宮頸癌的臨床分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)，PEBP4在浸潤(rùn)肌層有意義，而mTOR無(wú)明顯意義，可能與本研究標(biāo)本量較少有關(guān)。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達(dá)水平和蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)，提示兩者可能在同一信號(hào)通路中起調(diào)控作用。本研究為下一步采用RNA干擾和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)探討沉默PEBP4表達(dá)是否能夠抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力及調(diào)控的具體機(jī)制如何提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，PEBP4有望成為宮頸癌特異性治療的新靶點(diǎn)。