李雪松， 謝方圓， 農(nóng)秋蓮， 張勁松， 王 群， 吳 昊， 阮祥春*

(1.安徽省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，安徽 合肥 230001； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230091)

腎臟對(duì)蛋白質(zhì)代謝起著多方面作用，包括低分子量蛋白質(zhì)降解和氨基酸合成。腎功能衰竭患者隨著時(shí)間的推移會(huì)繼續(xù)失去腎功能，最終進(jìn)展至終末期腎病。急性腎功能衰竭(ARF)是臨床常見(jiàn)的并發(fā)癥，并且能引起較高的死亡率[1]。ARF產(chǎn)生可由嚴(yán)重的創(chuàng)傷、休克、敗血癥等引起，同時(shí)與臨床治療方式也有密切的關(guān)系。另外過(guò)量接觸有毒性的重金屬(例如鉛、汞或鉻等)也能引起急性腎衰。臨床上常測(cè)定血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)作為判斷腎衰的主要指標(biāo)。氯化汞誘導(dǎo)的腎臟毒性是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，其特征是血清Cr和BUN濃度升高，嚴(yán)重的近端腎小管壞死，繼而惡化和腎功能衰竭[2]。

正常成人或腎功能衰竭患者口服某些氨基酸增加腎小球?yàn)V過(guò)率[3]，可緩解腎衰對(duì)機(jī)體造成的危害。此外，少量必需氨基酸導(dǎo)致氮平衡增加，尿素氮的血清水平降低[4]。 Naylor發(fā)現(xiàn)對(duì)急性腎衰的病人使用必需氨基酸，病人的存活率高于未使用氨基酸24%的存活率[5]，得出了必需氨基酸是急性腎衰患者營(yíng)養(yǎng)需要中重要組分的結(jié)論。這些發(fā)現(xiàn)指出了氨基酸對(duì)ARF的重要性，特別是對(duì)于正常蛋白質(zhì)合成和避免氨基酸不平衡[6-7]。

本研究目的是利用氯化汞誘導(dǎo)的ARF，使用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化氨基酸溶液組方。響應(yīng)面法(RSM)是一種有價(jià)值的數(shù)學(xué)理論和統(tǒng)計(jì)技術(shù)，可以通過(guò)復(fù)雜的相互作用建立可變參數(shù)優(yōu)化模型。應(yīng)用RSM分析自變量對(duì)效應(yīng)的影響，優(yōu)化當(dāng)前Box-Behnken中的兩個(gè)BUN和Cr單獨(dú)參數(shù)，通過(guò)氯化汞誘導(dǎo)性腎衰竭模型以獲得對(duì)小鼠急性腎衰竭具保護(hù)作用氨基酸溶液的最佳組方。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 18～22 g昆明種小鼠，雌雄各半，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 氯化汞(上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；亮氨酸(Leu)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)和谷氨酰胺(Gln)均購(gòu)于合肥欣得生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基酸溶液的制備 通過(guò)部分因子試驗(yàn)從12個(gè)氨基酸[2, 6-7]中選擇Leu、Thr、Met、Ile、Val、Arg、His和Gln 8個(gè)氨基酸。然后，依據(jù)部分因子試驗(yàn)結(jié)果，選擇Leu、Thr和Met通過(guò)RSM的優(yōu)化。其中A為L(zhǎng)eu(低水平：10.00 g，高水平：20.00 g)，B為Thr(低水平：1.00 g，高水平：9.00 g)和C為Met(低水平：1.00 g， 高水平：10.00 g)。對(duì)三因素2水平利用Design Expert 8.06軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)15個(gè)氨基酸組方的試驗(yàn)組，在中心點(diǎn)設(shè)置有3個(gè)重復(fù)(表1)。氨基酸溶液組成中除了含有Leu、Thr和Met外，同時(shí)還含有部分因子試驗(yàn)得出的Ile、Val、Arg、His和Gln組分，均以相同比例與Leu、Thr和Met混合。按照15個(gè)組方的氨基酸比例，稱取一定質(zhì)量的氨基酸，加入適量水，用高速組織勻漿機(jī)20 000 rpm進(jìn)行處理，制備不同組方的氨基酸溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及給藥 將體重為18～22 g的昆明種小鼠136只，雌雄各半，分成17個(gè)組，每組8只。小鼠在室溫為25±2 ℃環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，喂飼清潔飼料，自由飲水。試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，氨基酸1～15組。除對(duì)照組外，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)劑量，配制1 mg/mL 氯化汞按照5 mg/kg對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射；陰性對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。在注射之前，老鼠需要禁食12 h。在氯化汞腹腔注射24 h后，氨基酸組口服0.2 mL的按照1～15組制備的氨基酸溶液，陰性、陽(yáng)性對(duì)照組口服同等體積的生理鹽水。

1.2.3 樣品采集 口服氨基酸試驗(yàn)持續(xù)5 d，在最后一次口服氨基酸12 h后，將小鼠用乙醚麻醉，斷頭取血。將采集的血液，3 500 rpm離心10 min，吸取血清，冷凍保存，待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

血清樣品的BUN和Cr由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0軟件。數(shù)據(jù)參數(shù)的分析采用單因素方差分析，然后利用最小顯著性差異法比較結(jié)果，P<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與血清中BUN和Cr結(jié)果

陰性對(duì)照組的小鼠血清中的BUN和Cr分別為5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L；陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠血清中的BUN和Cr分別為58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。按照3因素Box-Behnken設(shè)計(jì)的15個(gè)氨基酸組方，分析對(duì)氯化汞誘導(dǎo)的急性腎衰模型中的BUN和Cr有不同程度的影響。具體氨基酸組方及相應(yīng)的血清生化結(jié)果(表1)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)和相應(yīng)響應(yīng)值

*注：運(yùn)行的順序在試驗(yàn)期間是隨機(jī)的，以降低誤差。

*Note：The order of the runs was randomized during experiment to minimize selection error.

2.2 響應(yīng)面模型的分析

依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)中的血清BUN和Cr結(jié)果，對(duì)響應(yīng)面的模型進(jìn)行分析。在模型的方差分析中，3種氨基酸對(duì)BUN的P<0.01,對(duì)Cr的P<0.05,說(shuō)明3種氨基酸的響應(yīng)面篩選的方法是有效的。在BUN和Cr模型中的失擬項(xiàng)的參數(shù)F的值分別為0.22和0.41，均不顯著(P>0.05)，說(shuō)明該試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)是有效的，數(shù)據(jù)差異在有效范圍內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果表明亮氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸對(duì)小鼠血清中的BUN和Cr均有一定的影響。其中因素B、C、AC、A2、B2和C2對(duì)小鼠血清中的BUN產(chǎn)生極顯著的影響(P<0.01)(表2)。因素A2和C2對(duì)小鼠血清中的Cr有著極顯著的影響(P<0.01)，而因素AC、BC和B2對(duì)小鼠血清中的Cr有著顯著的影響(P<0.05)(表3)。

表2 響應(yīng)面二次模型的方差分析 (BUN)

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析(Cr)

2.3 氨基酸組方優(yōu)化

RSM成功地優(yōu)化了與血清BUN和Cr水平相關(guān)的氨基酸組成。為了提供更好的可視化，三維圖和等高線圖顯示了ARF小鼠血清BUN和Cr水平與Leu、Thr和Met的相互關(guān)系(圖1)。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳氨基酸組合物是：Leu 19.94 g、Thr 1.03 g和Met 6.53 g。 在此條件下，預(yù)測(cè)急性腎功能衰竭血清的BUN和Cr分別為5.93 μmol/L和34.00 mmol/L(表4)。

圖1 不同因素變量對(duì)響應(yīng)變量(3D響應(yīng)面)相互作用的影響

圖2 不同因素變量對(duì)響應(yīng)變量(等高線圖)相互作用影響

效應(yīng)Response預(yù)測(cè)Prediction標(biāo)準(zhǔn)差Std Dev標(biāo)準(zhǔn)誤SE95%置信區(qū)間95% Confidence95%低區(qū)間95%高區(qū)間BUN5.928 335.213 326.884 71-11.769 423.626Cr34.0019.386 5212.395 82.136 5265.865 5

3 結(jié)論與討論

最近，RSM被普遍應(yīng)用與各種領(lǐng)域，如納米技術(shù)，化學(xué)和醫(yī)學(xué)[8-12]。 RSM可用于通過(guò)復(fù)雜的相互作用建立優(yōu)化模型[13-15]。事實(shí)上，血清中Cr和BUN的濃度主要是評(píng)估臨床中腎臟疾病的指標(biāo)。RSM闡明了不同的氨基酸及其相互作用對(duì)血清中BUN和Cr濃度的影響，利用RSM優(yōu)化了氨基酸組成對(duì)氯化汞誘導(dǎo)急性腎衰模型小鼠具有一定的作用。許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻鳎被峥筛纳七M(jìn)行性腎損害[16]。在本研究中，氨基酸溶液給小鼠口服后降低氯化汞模型中小鼠的血清Cr和BUN水平。 氨基酸對(duì)Cr和BUN濃度的作用可歸因于改善腎小球的濾過(guò)率。ARF引起的死亡率可以高達(dá)50%，在這項(xiàng)研究中，氨基酸組的小鼠未見(jiàn)死亡，而陽(yáng)性對(duì)照組死亡率則為25%。口服氨基酸溶液能降低小鼠對(duì)氯化汞引起的急性腎衰的死亡率。在5 mg/kg的劑量下腹腔注射氯化汞，小鼠血清中的BUN和Cr分別為58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。與對(duì)照組的的BUN和Cr分別為5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L相比，可以成功對(duì)小鼠進(jìn)行急性腎衰的病理造模。亮氨酸,蘇氨酸,甲硫氨酸均對(duì)血清的肌酐和尿素氮具有不同程度的影響，利用響應(yīng)面法獲得的最佳組方為亮氨酸19.94 g，蘇氨酸1.03 g，甲硫氨酸6.53 g。

本試驗(yàn)通過(guò)氯化汞對(duì)小鼠誘導(dǎo)急性腎衰模型，以小鼠血清中的BUN和Cr為主要考察指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化氨基酸的最佳組方。從目前的血清生化指標(biāo)來(lái)看，氨基酸組合物能降低氯化汞誘導(dǎo)急性腎衰小鼠的血清中的BUN和Cr，至于優(yōu)化后的氨基酸組方對(duì)氯化汞誘導(dǎo)的急性腎衰保護(hù)作用的大小，需要通過(guò)組織病理學(xué)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。