高中月 王旋 何艮

摘要：為研究在飼料中添加不同水平的精氨酸對大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）幼魚生長、血漿游離氨基酸和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，以酪蛋白和明膠為蛋白源設(shè)計三組等氮等脂的純化飼料，在基礎(chǔ)配方中分別添加0%、2%、4%的晶體L-精氨酸，分別命名為LA、MA和HA處理組，用上述 3種試驗飼料分別飼喂初始體重為（13.30±0.01）g的大菱鲆幼魚8周。結(jié)果顯示，精氨酸不足（LA）和精氨酸過量（MA）都顯著降低了魚體的生長性能 （P<0.05）。隨著飼料中精氨酸的添加量提高，血漿游離精氨酸濃度顯著升高 （P<0.05）。精氨酸缺乏還造成了血漿游離蛋氨酸和蘇氨酸濃度的下降，而絲氨酸和甘氨酸濃度升高 （P<0.05）。此外，精氨酸缺乏造成了腸道褶皺、上皮細胞和微絨毛高度的降低 （P<0.05）。這些結(jié)果表明精氨酸在大菱鲆的生長、氨基酸代謝和腸道健康上發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)鍵詞：精氨酸；生長；血漿游離氨基酸；腸道形態(tài)；大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）

精氨酸是魚類的必需氨基酸之一，在蛋白質(zhì)的合成和代謝方面都發(fā)揮著重要的作用。精氨酸也是肌酸、多胺、一氧化氮（NO）等多種生物活性物質(zhì)的前體，具有調(diào)節(jié)魚體的能量代謝、免疫反應(yīng)和內(nèi)分泌等多種生理功能[1-2]。大量的研究表明精氨酸缺乏會造成哺乳動物、家禽、魚類的生長緩慢、飼料利用下降、腸道損傷、氧化損傷等問題[3-5]。

腸道是水產(chǎn)動物重要的營養(yǎng)和免疫器官，是氨基酸末端消化吸收和代謝的主要場所[6]。在哺乳動物和細胞水平上的研究表明精氨酸在維持腸道健康、預(yù)防腸道疾病和修復(fù)腸道損傷方面發(fā)揮著重要的作用[7-9]。然而，對于自身不能合成精氨酸或合成精氨酸能力很弱的魚類，精氨酸對魚類腸道影響的研究卻非常有限。

大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）在我國俗稱“多寶魚”，是一種我國北方廣泛養(yǎng)殖的海水底棲肉食性魚類。大菱鲆的人工養(yǎng)殖高度依賴于人工配合飼料的質(zhì)量，營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏或不平衡容易造成大菱鲆的腸道損傷，從而影響魚體的生長和品質(zhì)。因此，本實驗通過設(shè)計不同精氨酸水平的飼料，研究其對大菱鲆幼魚的生長性能、血漿游離氨基酸和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響。為保證研究目的，實驗飼料以純化飼料為基礎(chǔ)以避免其他因子可能造成的影響。

1材料和方法

1.1飼料配方和飼料制作

以Wang[10]的實驗飼料配方為參考，設(shè)計三組等氮（52%粗蛋白）等脂（12.5%粗脂肪）的純化飼料。按照大菱鲆幼魚魚體氨基酸組成添加除精氨酸以外的其他晶體氨基酸，設(shè)計出精氨酸缺乏的基礎(chǔ)配方[11]。然后在基礎(chǔ)配方中分別添加0%、2%、4%的晶體L-精氨酸（純度>99%，青島福林生物科技有限公司），分別命名為LA、MA和HA處理組，具體實驗配方見表1。飼料精氨酸的實測值為LA（1.50%）、MA（3.46%）、HA（5.45%），實驗飼料氨基酸組成見表2。

酸0.13，丙氨酸132，天門冬氨酸1.63，甘氨酸1.62，絲氨酸0.42，半胱氨酸040，酪氨酸0.10。

4維生素預(yù)混料（mg/kg飼料）：維生素A，32；維生素D，5；維生素E，240；維生素K，10；維生素B1，25；維生素B2，45；維生素B6，20；維生素B12，10；泛酸鈣，60；煙酸，200；葉酸，20；生物素，60；肌醇，800；維生素磷酸酯，2 000；微晶纖維素，16 473

5礦物質(zhì)預(yù)混料（mg/kg飼料）：MgSO4·7H2O， 1 200； CuSO4·5H2O， 10； FeSO4·7H2O， 80； ZnSO4·H2O， 50； MnSO4 ·H2O， 45； CoCl2， 5； Na2SeO3，20； 碘酸鈣， 60； 沸石粉， 8 485

6復(fù)合誘食劑：甜菜堿∶二甲基-丙酸噻亭∶甘氨酸∶丙氨酸∶5-磷酸肌苷=4∶2∶2∶1

7精氨酸：（福林生物科技有限公司，山東，中國）L-精氨酸，純度99.8%

飼料制作前，飼料原料經(jīng)超微粉碎機粉碎并過320 μm篩。然后按照飼料配方將各種飼料原料準確稱量并充分混合。然后再加入適量的蒸餾水并用手充分揉勻。最后將混合好的飼料原料放入自動制粒機中制成大小均勻的飼料顆粒，將飼料顆粒在50 ℃恒溫下熱風(fēng)干燥8 h，將風(fēng)干后的飼料置于雙層塑料袋中，并保存在-20 ℃冰箱中。

1.2實驗過程和飼養(yǎng)管理

實驗用大菱鲆幼魚是從山東省萊州市大菱鲆種苗場購買的當年人工培育的同一批苗種。養(yǎng)殖實驗在青島億海豐水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。實驗開始之前，用MA處理組飼料暫養(yǎng)大菱鲆幼魚2周，以使大菱鲆幼魚適應(yīng)養(yǎng)殖系統(tǒng)環(huán)境和純化飼料。暫養(yǎng)結(jié)束后將實驗魚禁食24 h，挑選規(guī)格均一、體格健壯的大菱鲆幼魚（初始平均體重：13.30± 0.01 g），并隨機分配于9個養(yǎng)殖桶（300 L），每桶30尾。

養(yǎng)殖實驗周期為8周，每天按照大菱鲆體重的1.5%定量投喂兩次（8：00和18：00），飼喂量每兩周根據(jù)每桶的魚體總重調(diào)整一次。攝食結(jié)束后進行換水以保證水質(zhì)。養(yǎng)殖試驗期間，水溫保持在18～22 ℃，鹽度29‰～32‰，氨氮小于0.1 mg/L，亞硝酸鹽小于0.1 mg/L，溶解氧含量大于7 mg/L。

1.3樣品采集

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，實驗魚被禁食24 h以達到基礎(chǔ)的新陳代謝水平。取樣前將試驗魚用丁香酚（純度99%，1∶10 000）麻醉，然后分別統(tǒng)計每桶魚的重量和數(shù)量并隨機選取5尾魚用于魚體常規(guī)成分分析。每桶隨機選取2尾魚，分別測量其魚體重量、魚體長度、內(nèi)臟團重量、肝臟重量并記錄數(shù)據(jù)。每桶隨機選擇3尾魚，用注射器從魚的尾靜脈取出血液并將其放入抗凝管中，然后將血液在4 ℃ 3 000 g下離心5 min，將離出的上清液收集在離心管中并儲存在-80 ℃冰箱備用。每桶再隨機選擇2尾魚用于腸道組織學(xué)分析取樣，選取后腸中間部分（約0.5 cm長）放入事先配好的波恩氏液中，24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精中直到進行腸道組織分析。

1.4魚體和飼料常規(guī)組成分析

魚體和飼料常規(guī)成分分析均采用 AOAC制定的方法。其中水分的測定采用105 ℃ 烘箱烘干至恒重的方法求得；粗蛋白質(zhì)含量采用全自動凱氏定氮儀（Kjeltec 8400，瑞典FOSS）測定；粗脂肪含量采用索氏抽提儀（Soxtec 8000，瑞典 FOSS）測定。

1.5原料和飼料氨基酸組成分析

將飼料原料和飼料用冷凍干燥機凍干（ALPHA1-2 LD plus，德國Christ），隨后在水解管中加入20～40 mg樣品（準確稱量），然后加入10 mL 6 M HCl，用氮吹儀排出水解管中的空氣后將其密封，在110 ℃條件下水解22 h。將水解好的樣品用50 mL的容量瓶定容并充分混合，然后準確吸出1 mL轉(zhuǎn)入到離心管里，用氮吹儀將離心管里的液體吹干后加入1 mL 0.02 M HCl并充分溶解。最后，溶液用0.2 μm濾膜過濾并導(dǎo)入到進樣瓶里，使用配備鈉離子交換柱的全自動氨基酸檢測儀（L-8900，日本HITACHI）檢測氨基酸含量。

1.6血漿游離氨基酸分析

將冷凍的血漿樣品在4 ℃下解凍，解凍后將每個樣品準確吸取400 μL加入1.2 mL 10%磺基水楊酸并充分混合，靜止5 min后，13 000 r/min 4 ℃離心15 min，然后吸取上清液1 mL左右并用0.2 μm濾膜過濾到進樣瓶中，使用配備鋰離子交換柱的全自動氨基酸檢測儀（L-8900，日本HITACHI）檢測游離氨基酸含量。

1.7腸道組織學(xué)分析

后腸組織樣品經(jīng)過波恩氏液固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切片（5 μm）、蘇木精-伊紅染色制成腸道組織切片。在帶有拍照系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡下（Olympus， CX31）用AJ-VERT軟件統(tǒng)計后腸褶皺高度（HF）、腸上皮細胞高度（HE）和微絨毛長（HMV）。

1.8計算公式和統(tǒng)計方法

存活率（SR，%）=100×魚終末數(shù)量/魚初始數(shù)量

增重率（WGR，%）=100×（魚終末體重-魚初始體重）/魚初始體重

特定生長率（SGR，%/d）=100×（ln魚終末體重-ln魚初始體重）/養(yǎng)殖天數(shù)

飼料效率（FE）= 魚體濕增重/攝食飼料量

蛋白質(zhì)效率（PER）= 魚體濕增重/攝食蛋白量

肥滿度（%）= 100×魚體重/魚體長3

肝體比（HSI，%）= 100×肝臟重/魚體重

臟體比（VSI，%）= 100×內(nèi)臟團重/魚體重

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤（M±SE）表示，采用 SPSS 17.0 版軟件對所得數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，先對數(shù)據(jù)作單因子方差分析（ANOVA），若處理間有顯著差異，再作 Tukeys多重比較，P<0.05 表示差異性顯著。

2結(jié)果

2.1生長性能和飼料利用

飼料中精氨酸水平對大菱鲆幼魚生長性能和飼料利用的影響如表3所示。所有大菱鲆幼魚在養(yǎng)殖期間均未出現(xiàn)死亡。然而，與MA組相比，精氨酸缺乏（LA組）顯著降低了魚體的終末體重（FBW）、增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、飼料效率（FER）和蛋白質(zhì)效率（PER）（P<0.05）。另外，與MA組相比，飼料中過量的精氨酸水平（HM組）也造成了魚體的終末體重（FBW）、增重率（WGR）和特定生長率（SGR）的降低（P<005）。

2.2形態(tài)指標和魚體組成

飼料中精氨酸水平對大菱鲆幼魚形態(tài)指標和魚體組成的影響如表4所示。飼料中精氨酸水平的改變并沒有引起大菱鲆肥滿度（CF）、肝體比（HSI）、臟體比（VSI）的顯著性變化（P>0.05）。然而，與LA組和MA組相比，HA組的魚體水分顯著提高，粗脂肪顯著降低（P<0.05）。

2.3血漿游離氨基酸

飼料中精氨酸水平對大菱鲆幼魚血漿游離氨基酸的影響如表5所示。在必需氨基酸方面，LA組的血漿游離精氨酸顯著低于MA組（P<005），HA組的血漿游離精氨酸顯著高于MA組（P<0.05）。另外，LA組的血漿游離蛋氨酸和蘇氨酸顯著低于MA組（P<0.05）。在非必需氨基酸方面，與MA組相比，HA組的血漿游離天門冬氨酸、絲氨酸和甘氨酸顯著降低，LA組的血漿游離絲氨酸顯著升高（P<0.05）。

2.4腸道組織形態(tài)

飼料中精氨酸水平對大菱鲆幼魚腸道組織形態(tài)的影響如圖1所示，組織學(xué)參數(shù)如表6所示。LA組的腸道褶皺高度（HF）和腸道微絨毛高度（HMV）顯著低于MA組（P<0.05）。MA組的腸上皮細胞高度（HE）顯著低于MA組和HA組（P<0.05）。HA組與MA組在腸道組織學(xué)指標沒有顯著性差異（P>0.05）

3討論

大菱鲆幼魚對精氨酸的需求量的研究表明，以特定生長率為判定指標大菱鲆幼魚對飼料中精氨酸的適宜需要量為飼料干重的3.13%[12]。我們以此為依據(jù)在飼料中設(shè)計了三種精氨酸添加水平，分別為精氨酸缺乏的LA飼料，精氨酸適宜的MA飼料和精氨酸過量的HA飼料。經(jīng)過八周的養(yǎng)殖實驗，我們測定了飼料中精氨酸水平對大菱鲆生產(chǎn)性能和飼料利用的影響。結(jié)果顯示，精氨酸缺乏顯著降低了大菱鲆魚體末重（FBW）、增重率（WGR）、特定生長率（SGR）、飼料效率（FER）和蛋白質(zhì)效率（PER）。在飼料中添加適量的晶體精氨酸，魚體的生長和飼料利用情況顯著改善。然而，當飼料中精氨酸過量時，魚體的生長受到抑制。此類現(xiàn)象還出現(xiàn)在其他多種魚類上，如團頭魴（Megalobrama amblycephala）[13]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[14]、金昌魚（Trachinotus ovatus）[7]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[15]和青石斑魚（Epinephelus awoara）[16]。這些結(jié)果表明精氨酸在大菱鲆幼魚的生長和營養(yǎng)利用上發(fā)揮著重要作用，在飼料中適量地補充晶體氨基酸有利于大菱鲆的生長和飼料利用。

另外，飼料中精氨酸水平也影響魚體組成。飼喂HA飼料的魚體表現(xiàn)為較低的粗脂肪含量。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在團頭魴（Megalobrama amblycephala）[17]和黑鯛（Sparus macrocephalus）[18]上。精氨酸降低魚體脂肪含量的作用可能與精氨酸的重要代謝產(chǎn)物一氧化氮（NO）有關(guān)。在哺乳動物上的研究發(fā)現(xiàn)NO有調(diào)節(jié)脂肪和葡萄糖代謝的作用，NO可以促進長鏈脂肪酸氧化，抑制脂肪合成和糖異生，激活A(yù)MPK通路[19-21]。在豬和雞的研究中也表明，精氨酸有降低體脂肪的作用[22-23]。

血漿游離氨基酸是動物蛋白質(zhì)分解與氨基酸利用動態(tài)的中間形式，血漿各游離氨基酸的含量能夠反映機體氨基酸代謝的概況。本研究中，血漿精氨酸的濃度隨著飼料中精氨酸的添加顯著性提高，這與在團頭魴（Megalobrama amblycephala）[17]和羅非魚（Oreochromis sp）[24]上的研究結(jié)果相一致。精氨酸在動物體內(nèi)有多種代謝途徑，能夠產(chǎn)生NO、鳥氨酸、尿素、多胺、肌酸、谷氨酰胺等多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物在魚體新陳代謝上都發(fā)揮著重要的作用[1]。因此，血漿中游離精氨酸濃度的改變必然伴隨著精氨酸代謝的改變，從而影響這個血漿氨基酸庫的變化。對于其他必需氨基酸，飼料中精氨酸的缺乏引起了血漿蛋氨酸濃度的降低，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在團頭魴（Megalobrama amblycephala）上[17]。這可能與精氨酸的代謝產(chǎn)物肌酸相關(guān)。肌酸是重要的能量代謝分子，其主要功能是促進ATP的循環(huán)[25]。蛋氨酸提供的甲基是精氨酸代謝生產(chǎn)肌酸必不可少的條件，因此肌酸的生物合成可以一定程度上調(diào)控蛋氨酸的代謝反應(yīng)[25]。另外，飼料中精氨酸缺乏還導(dǎo)致了血漿蘇氨酸濃度的降低，蘇氨酸在提高魚類免疫作用，調(diào)節(jié)脂肪代謝，維持腸道狀態(tài)方面都發(fā)揮著重要的作用。然而，精氨酸與蘇氨酸在代謝上的相互作用還需進一步研究。

腸道是魚體重要的營養(yǎng)器官和免疫器官，并負責(zé)氨基酸的消化、吸收、代謝[6]。大量的研究結(jié)果表明植物蛋白替代魚粉會造成腸道絨毛破壞和腸道黏膜病變[26]。然而，作為植物蛋白源的一個主要限制因素，氨基酸不平衡對魚類腸道形態(tài)的影響卻非常有限。本研究中我們分析了飼料中不同精氨酸水平對大菱鲆后腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示精氨酸缺乏顯著降低了大菱鲆后腸的腸道褶皺、上皮細胞和微絨毛的高度。這說明精氨酸與腸道上皮的生長密切相關(guān)，精氨酸缺乏影響了腸道的消化吸收能力。在雜交條紋鱸（Morone chrysops×Morone saxatilis）上也有相似的結(jié)果[27]。另外，Chen[28]的研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量精氨酸可以緩解大菱鲆由于飼喂豆粕所引起的腸道炎癥。在哺乳動物上的研究顯示精氨酸可以通過NO途徑和非NO途徑作用于腸道發(fā)揮保護腸道的作用[8]。精氨酸的一條代謝途徑是在精氨酸酶的作用下分解為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸是合成多胺類物質(zhì)（腐胺、尸胺、精胺等）的前體，多胺有著重要的生理功能，在腸道細胞生長、增殖和分化上發(fā)揮著重要作用[29]。精氨酸另一條代謝途徑是在一氧化氮合成酶（NOS）作用下生成瓜氨酸和NO。研究表明NO有調(diào)節(jié)腸粘膜屏障完整性的作用[30]。

4結(jié)論

綜上所述，當前研究表明飼料中精氨酸缺乏或過量都會抑制大菱鲆幼魚的生長。不同的精氨酸攝入量不僅影響血漿游離精氨酸濃度還會引起多種氨基酸代謝反應(yīng)，從而影響整個血漿游離氨基酸庫。另外，精氨酸與腸道上皮的生長密切相關(guān)，精氨酸缺乏影響了腸道的消化吸收能力。本實驗說明精氨酸在大菱鲆營養(yǎng)生理和腸道健康上發(fā)揮著重要作用，并且為探索精氨酸在硬骨魚上的功能提供了新的線索。

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Effect of dietary arginine levels on growth， plasma free amino acids and intestinal morphology in juvenile turbot （Scophthalmus maximus L.）

GAO ZhongYue， WANG Xuan， HE Gen

（The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds， Ministry of Agriculture， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）

Abstract：A feeding trial was conducted to evaluate the effect of dietary arginine levels on growth， plasma free amino acids and intestinal morphology in juvenile turbot （Scophthalmus maximus L.）. Three isonitrogenous and isolipidic purified diets were formulated with casein and gelatin as protein source. 0%，1.0% and 2.0% arginine were added to the basal diet to denominate LA， MA and HA diet， respectively. After the feeding trial， fish growth were significantly reduced by LA diet and HA diet （P<0.05）. The plasma free arginine concentration increased significantly following increased addition of dietary arginine （P<0.05）. Dietary arginine deficiency also resulted in a decrease of plasma free methionine and threonine， while serine and glycine concentrations increased （P<005）. Furthermore， arginine deficiency decreased the height of intestinal fold， enterocyte and microvilli （P<0.05）. These results indicate that arginine plays an important role in the growth， amino acid metabolism and intestinal health of turbot.

Key words：arginine； growth； plasma free amino acids； intestinal morphology；turbot（Scophthalmus maximus L.）

（收稿日期：2018-05-22）