李爽 姚宇 李鶴 田威（通訊作者）

（1遼寧成大生物股份有限公司 遼寧 沈陽(yáng) 110179）

（2沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110015）

狂犬病，俗稱恐水病，是一種由狂犬病病毒感染引起的人獸共患傳染病，一旦感染發(fā)病，病死率高達(dá)100%。狂犬病至今仍無特效的治療方法，實(shí)施疫苗免疫是預(yù)防和控制狂犬病發(fā)病最有效的措施[1]。在疫苗生產(chǎn)的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)中，狂犬病毒毒力的測(cè)定是至關(guān)重要的，其直接關(guān)系到疫苗成品的效價(jià)和免疫效果?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》三部（2015版）狂犬病毒滴度檢測(cè)的方法推薦采用小鼠法。但是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間存在個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)人員操作的熟練程度等諸多因素均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。細(xì)胞法作為病毒滴度測(cè)定的一種替代方法，近年來廣受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞，其中蝕斑法、免疫熒光法等都是比較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。

1.材料和方法

1.1 病毒及細(xì)胞 病毒株

狂犬病毒PV-2061株第18代，由遼寧成大生物股份有限公司提供，原始毒株來源于ATCC。細(xì)胞株：幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）來源于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系SPF級(jí)小鼠，雄性，體重11～13g，來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 主要試劑

FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒特異性熒光抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司，濃度0.93mg/ml；新生牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；甲基纖維素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 蝕斑法

1.4.1 制備單層細(xì)胞 將BHK-21細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/ml，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長(zhǎng)滿單層備用。

1.4.2 病毒滴度測(cè)定 將狂犬病毒樣品5倍稀釋，然后進(jìn)行10倍系列稀釋，共6個(gè)稀釋度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接種至已制備好的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)吸附90min，每隔15min輕搖板一次，然后加入甲基纖維素覆蓋液，4ml/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，棄去覆蓋液，加入結(jié)晶紫染色液，2ml/孔，室溫30min后棄去染色液，用自來水沖洗至流水無色，晾干，細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)蝕斑清晰可見。統(tǒng)計(jì)各孔蝕斑數(shù)，計(jì)算結(jié)果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。

PFU/ml=（每孔平均蝕斑數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)）/每孔接種病毒量

1.5 免疫熒光法

1.5.1 制備單層細(xì)胞 將Vero細(xì)胞調(diào)整濃度至1×105個(gè)/ml，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，長(zhǎng)滿單層后備用。

1.5.2 病毒滴度測(cè)定 用細(xì)胞培養(yǎng)液將待測(cè)的狂犬病毒樣品以10倍系列稀釋，共6個(gè)稀釋度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接種至制備好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μL/孔，每個(gè)稀釋度6孔，每塊板上設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔和病毒陽(yáng)性對(duì)照孔，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后，用PBS洗板3次，室溫干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后棄丙酮，置室溫干燥，然后用100×稀釋的熒光抗體進(jìn)行染色，50μL/孔，置濕盒內(nèi)37℃溫育30min，洗板3次，甘油封閉，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)病毒感染細(xì)胞的熒光灶數(shù)，細(xì)胞漿內(nèi)有綠色特異性熒光顆粒者為陽(yáng)性。正常細(xì)胞對(duì)照無特異性熒光，病毒對(duì)照陽(yáng)性者為有效，以Reed-Muench法計(jì)算感染性滴度[2]。

1.6 小鼠LD50測(cè)定法

將病毒樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，腦內(nèi)接種11～13g的小鼠，每個(gè)稀釋度注射6只，0.03ml/只。連續(xù)觀察14d，3天后死亡或呈典型發(fā)病癥狀的小鼠均計(jì)入死亡數(shù)內(nèi)，計(jì)算LD50。

2.結(jié)果

12份病毒液樣品分別用蝕斑法、免疫熒光法及小鼠腦內(nèi)滴定法測(cè)定病毒滴度，結(jié)果見表1。蝕斑法、免疫熒光法分別與小鼠法進(jìn)行比較，均顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.154，0.699，均為P＞0.05），相關(guān)系數(shù)為0.646，0.859，說明蝕斑法和免疫熒光法的檢測(cè)結(jié)果與小鼠LD50法呈良好的正相關(guān)性。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，同一份病毒樣本分別用蝕斑法和免疫熒光法檢測(cè)6次，結(jié)果見表2。蝕斑法測(cè)得的lgPFU/ml值的范圍為6.62～7.11，變異系數(shù)為2.41%；免疫熒光法測(cè)得的lgFFU/ml值的范圍為6.69～7.00，變異系數(shù)為1.69%。說明免疫熒光法有更好的重復(fù)性，精密度更高。

表1 三種方法測(cè)定狂犬病毒滴度的比較

表2 蝕斑法、免疫熒光法重復(fù)測(cè)定同一批樣品的病毒滴度

3.討論

國(guó)內(nèi)狂犬病毒的毒力測(cè)定一直沿用小鼠LD50法，隨著越來越多的人關(guān)注動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利等問題，細(xì)胞替代法將成為一個(gè)必然趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)條件相對(duì)比較好控制，不同批次的細(xì)胞均來源于同一株細(xì)胞，重復(fù)性較好，檢測(cè)時(shí)間也相對(duì)較短。WHO推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法為免疫熒光法，可精確計(jì)數(shù)被病毒感染的細(xì)胞個(gè)數(shù)，此法敏感且特異性好。目前，國(guó)內(nèi)也已經(jīng)開始采用免疫熒光法控制狂犬病疫苗的生產(chǎn)過程[3-5]。蝕斑法，從理論上講，一個(gè)蝕斑是由一個(gè)病毒顆粒感染一個(gè)易感細(xì)胞形成的，因而該項(xiàng)技術(shù)常用于病毒顆粒計(jì)數(shù)和分離病毒克隆，因此，以蝕斑法對(duì)毒力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)較直觀、客觀性強(qiáng)。目前這兩種方法均被廣泛用于狂犬病毒感染的診斷。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蝕斑法和免疫熒光法與小鼠LD50法檢測(cè)結(jié)果均呈良好的正相關(guān)性，可應(yīng)用于狂犬病毒株P(guān)V-2061病毒滴度的檢測(cè)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示免疫熒光法的精密度更好，值得推廣用于狂犬病毒感染性滴度的檢測(cè)。