玉云 尹團(tuán)章 龐登紅

摘要：利用組織塊法、勻漿分離法、富集分離法從菠蘿中初篩得到8株產(chǎn)香菌，復(fù)篩出1株產(chǎn)花草香的菌株ZFF1。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，菌株ZFF1鑒定為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），屬于安全菌株。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)香菌；篩選；發(fā)酵；菌種鑒定

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）12-0036-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.010

Abstract： Eight aroma-producing strains were screened preliminarily from pineapples by using the methods of tissue culture，homogenate separation，and enrichment and separation. And a strain，ZFF1 producing the fragrances of flowers and herbs from 8 strains was obtained after secondary screening. The strain ZFF1 was identified as Hanseniaspora uvarum by morphological and molecular identification，and it was safe.

Key words： aroma-producing strains； screening； fermentation； species identification

產(chǎn)香微生物是指在生長過程中可以發(fā)酵代謝產(chǎn)生香味物質(zhì)的微生物，大部分為乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌和霉菌類，不同的產(chǎn)香微生物產(chǎn)生的香味物質(zhì)各不相同[1-4]。利用微生物產(chǎn)香天然、安全健康、周期短、不受原料的限制，既可降低成本，又可提高香料產(chǎn)量[5-8]，已廣泛應(yīng)用于香煙、果酒、香水、化妝品等領(lǐng)域[9-13]。產(chǎn)香微生物主要來源于酒醋醬油等發(fā)酵產(chǎn)品、土壤、天然植物。自然界植物資源豐富，特別是具有特殊香味的植物多種多樣，從植物組織分離已成為獲得產(chǎn)香菌株的重要途徑之一，已有從新鮮荔枝、西瓜和龍眼中分離得到產(chǎn)香菌株[14-16]。本試驗(yàn)擬從菠蘿果肉中篩選產(chǎn)香菌株，以應(yīng)用于煙葉、茶葉等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

菠蘿購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水果市場，茶葉為市售三級(jí)曬青茶。葡萄糖等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，加去離子水至1 L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，其余同PDA固體培養(yǎng)基。

1.2.2 菌株分離及純化 分別采用組織塊分離法[17]、組織勻漿法[18]和富集分離法[19]從菠蘿果肉中分離產(chǎn)香菌，用PDA固體培養(yǎng)基對(duì)分離得到的菌株不斷純化，直到完全分離出單一菌株。組織塊分離法、組織勻漿法和富集分離法分離得到的菌株分別用“ZKF+序號(hào)”“ZYF+序號(hào)”和“ZFF+序號(hào)”編號(hào)表示。

1.2.3 產(chǎn)香菌株初篩 將上述分離純化的單一菌株分別接入PDA培養(yǎng)基，以28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，由3～4人感官評(píng)選出產(chǎn)香濃郁且風(fēng)味怡人的產(chǎn)香菌，作為初篩菌種。

1.2.4 產(chǎn)香菌株復(fù)篩 以1∶50茶水比進(jìn)行沸水浸提10 min后，過濾，細(xì)菌瓶分裝10 mL/瓶，以121 ℃高壓蒸氣滅菌21 min。將菌株接種茶湯中，設(shè)置對(duì)照（不接菌），置于28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d，得菌種液。取滅菌茶葉（20 g/瓶），接種10 mL菌液，至茶葉含水量達(dá)到40%左右，分別設(shè)置空白、加無菌水、加無菌茶湯3個(gè)對(duì)照，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。參照黑茶審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)時(shí)側(cè)重于茶葉香氣，由5位審評(píng)員進(jìn)行審評(píng)，評(píng)分權(quán)數(shù)為：總分=香氣得分×40%+湯色得分×20%+滋味得分×30%+葉底得分×10%。依據(jù)得分高低，復(fù)篩出產(chǎn)香菌株。

1.2.5 產(chǎn)香菌株鑒定 對(duì)復(fù)篩出的產(chǎn)香菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定。分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌株的顯微結(jié)構(gòu)。用試劑盒提取菌株DNA，根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果選用合適的引物NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為（100 μL）Taq（5 U/μL）0.8 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/each）8 μL，模板DNA 2.5 ng；引物NL-1（10 μmol/L）2 μL，引物NL-4（10 μmol/L）2 μL；ddH2O補(bǔ)足到100 μL。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳回收，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測序，以BLAST軟件對(duì)所得序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果中同源性較高的序列挑選出并進(jìn)一步采用MEGA4.1軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定產(chǎn)香菌株的種屬[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的初篩

對(duì)分別采用組織塊分離法、組織勻漿法和富集分離法從菠蘿果肉中分離純化的單一菌株進(jìn)行感官初篩，共分離得到8株具有產(chǎn)香能力的菌株，結(jié)果見表1。由表1可以看出，ZYF2、ZYF3、ZYF5、ZFF3、ZFF4等具有果酒香氣，香氣怡人，但是經(jīng)過長時(shí)間存放之后，其香氣會(huì)變淡。ZFF1為米酒香，且香味濃郁，持續(xù)時(shí)間較長。初篩的大部分產(chǎn)香真菌均產(chǎn)酒香，這可能與使用PDA培養(yǎng)基有關(guān)，但各菌株的香氣濃郁程度和類型仍然存在一定區(qū)別。初篩所獲得的產(chǎn)香菌株中各有4株分別由組織勻漿法和富集分離法獲得，表明采用組織塊分離法不易分離獲得菠蘿果肉產(chǎn)香菌。

2.2 產(chǎn)香菌株的復(fù)篩

將初篩得到的8株產(chǎn)香菌進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)比較不同菌株發(fā)酵茶葉原料時(shí)的產(chǎn)香情況，篩選出最佳產(chǎn)香菌株，結(jié)果見表2。由表2可知，接種ZFF1和ZYF5的發(fā)酵樣香氣較好，分別為花草香和香料香。但從綜合審評(píng)結(jié)果來看，ZFF1發(fā)酵茶樣湯色橙紅、明亮，滋味焦糖味、帶花草香，葉底為豬肝色、帶青色，得分為84.23；而菠蘿ZYF5的發(fā)酵茶樣，湯色橙紅、明亮，滋味較醇正、帶花草香、葉底豬肝色、帶青色，得分為80.37。據(jù)此，選擇ZFF1為復(fù)篩的最佳產(chǎn)香菌株。

2.3 產(chǎn)香菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)特征 從PDA培養(yǎng)基上可以看出，菠蘿ZFF1為乳白色，菌體表面黏稠，但質(zhì)地不均（圖1A）。從顯微圖（圖1B）和電鏡圖（圖1C）可以看出，菌株個(gè)體形態(tài)為桿狀，無鞭毛，菌株大小在5～10 μm。

2.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA（D1/D2）區(qū)域位于酵母核糖體大亞基的5′端，大小在600 bp左右，這段區(qū)域具有較高的變異率。同種菌株26S rDNA（D1/D2）核苷酸差異率較小，不同種菌株差異率較大。利用PCR擴(kuò)增獲得ZFF1菌株的26S rDNA（D/D2）序列，并測序，根據(jù)不同序列的相似性繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[21]。由圖2可以看出，ZFF1菌株的26S rDNA（D/D2）序列與葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似性最高，為96%，因此初步確定ZFF1為葡萄有孢漢遜酵母。

3 小結(jié)與討論

3.1 菠蘿中可篩選產(chǎn)香菌

匡鈺[22]從菠蘿果皮中篩選出一株發(fā)酵性能較好的酵母菌，并采用原生體紫外誘變法對(duì)其進(jìn)行誘變，得到一株發(fā)酵性能優(yōu)良、適合菠蘿果汁發(fā)酵的釀酒酵母，優(yōu)化了菠蘿果酒和菠蘿果醋的發(fā)酵工藝。胡月英[23]從菠蘿園的土壤和菠蘿果實(shí)中經(jīng)過四級(jí)篩選，選出最佳發(fā)酵菌株A4C3，并初步鑒定為釀酒酵母，該株酵母菌能耐受19%的酒精度，能耐受pH 1.5的酸度和濃度為300 mg/L的二氧化硫，有較大發(fā)展?jié)摿?。王鵬霄[24]從菠蘿、草莓、蘋果等水果中分離篩選出2株產(chǎn)香菌，分別鑒定為Hanseniaspora sp.（有孢漢遜酵母屬）和Pichia caribbica（畢赤氏酵母屬）。由菠蘿產(chǎn)香菌相關(guān)研究情況可以看出，對(duì)菠蘿產(chǎn)香菌的研究較少，現(xiàn)有的菠蘿產(chǎn)香菌多為酵母菌，并且大多用于促進(jìn)果酒發(fā)酵工藝，而篩選獲得的產(chǎn)香菌可以應(yīng)用于食品等領(lǐng)域中。本研究從菠蘿果肉中篩選獲得的ZFF1，與王鵬霄[24]從草莓中分離得到高產(chǎn)香料HDMF的有孢漢遜酵母相同，說明在菠蘿果肉中容易分離得到葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

3.2 產(chǎn)香菌因培養(yǎng)材料而改變香氣

ZFF1菌株接種于PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)濃郁米酒香，而接種于茶葉中復(fù)篩時(shí)產(chǎn)花草香，這說明在不同培養(yǎng)材料上能產(chǎn)生不同香氣類型，這可能與產(chǎn)香菌發(fā)生作用的底物或菌種在不同環(huán)境中發(fā)酵效果不一致有關(guān)。后期需進(jìn)一步對(duì)ZFF1發(fā)酵不同原料產(chǎn)香情況進(jìn)行探究，尋找更加合適的發(fā)酵原料，并產(chǎn)生更加有特色的香氣類型。其次，需探究ZFF1發(fā)酵過程中香氣成分的動(dòng)態(tài)變化，分析菌株對(duì)哪些香氣成分影響較大。再者，根據(jù)香氣成分的變化，對(duì)相關(guān)酶的酶活進(jìn)行測定，探究ZFF1菌株產(chǎn)香機(jī)理。

3.3 產(chǎn)香菌應(yīng)用展望

目前產(chǎn)香菌大多應(yīng)用于煙酒及食品的生產(chǎn)加工。甄達(dá)文等[25]利用混合微生物發(fā)酵煙葉碎片，發(fā)現(xiàn)增香效果明顯。袁麗[26]分別從鴨梨果皮、獼猴桃中分離篩選獲得兩株酵母，并應(yīng)用于釀酒，發(fā)現(xiàn)釀制的鴨梨酒味道純正、典型性好。張雪梅[27]從香腸中篩選產(chǎn)香葡萄球菌并將其用于發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)其有較好的產(chǎn)香性能。王剛等[28]從重慶泡菜及揚(yáng)州豆醬等篩選得到1株季也蒙畢赤酵母，應(yīng)用于面包發(fā)酵與烘焙，發(fā)現(xiàn)其面團(tuán)發(fā)酵效果良好，且烘焙的面包囊風(fēng)味獨(dú)特。香精香料的生物合成中應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)是發(fā)酵工程，微生物法是生產(chǎn)較安全且有前途的方法[29，30]。利用微生物產(chǎn)香，所制取香料產(chǎn)物對(duì)果酒、果類飲料、香水、化妝品等領(lǐng)域都具有重大意義，還可以應(yīng)用于茶葉發(fā)酵工藝中，促進(jìn)茶葉香氣、滋味等品質(zhì)的提升。產(chǎn)香真菌在其他方面的應(yīng)用還需要投入更多的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉選明，張 鑫，徐 婷，等.一株香茅草內(nèi)生細(xì)菌Pantoea ananatis CcSH-1的分離、鑒定及產(chǎn)香條件優(yōu)化研究[J].湖南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，6（44）：112-118.

[2] 楊黎華，李祖紅，陳 東，等.香茅草產(chǎn)香內(nèi)生真菌的篩選及香氣成分分析[J].生物技術(shù)，2006，16（5）：53-56.

[3] 李雪梅，徐若飛，楊黎華，等.利用香莢蘭內(nèi)生菌制備天然香料及其在卷煙中的應(yīng)用[J].煙草科技，2008（3）：31-34，62.

[4] 張世秀，宋俊梅，曲靜然.酸漿中一株產(chǎn)香菌產(chǎn)香成分的分析[J].食品科技，2006，31（1）：22-23.

[5] 呂 品，李 丹，黃 龍，等.煙葉產(chǎn)香菌的分離及其在煙用香料制備中的應(yīng)用[J].煙草科技，2009（1）：37-42.

[6] 楊 麗.丙酸產(chǎn)生菌株的篩選及發(fā)酵工藝研究[D].南京：南京工業(yè)大學(xué)，2007.

[7] 劉 國.釀酒酵母轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-苯乙醇的研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2009.

[8] 林 山.微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素的研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2006.

[9] 郭 志.濃香型大曲中產(chǎn)香微生物的分離篩選及其產(chǎn)香條件的優(yōu)化[D].四川自貢：四川理工學(xué)院2014.

[10] VANDAMME E J，SOETAERT W. Bioflavours and fragrances via fermentation and biocatalysis[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology，2002，77（12）：1323-1332.

[11] 余 翔，李元實(shí)，劉 棟，等.一株增香微生物的分離鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)香條件優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28（4）：670-675.

[12] OMELIANSKI V L. Aroma-producing micro？觟rganisms[J].Journal of Bacteriology，1923，8（4）：393-419.

[13] KRINGS U，BERGER R G. Biotechnological production of flavours and fragrances[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，1998，49（1）：1-8.

[14] 朱育菁，王秋紅，陳 璐，等.龍眼內(nèi)生菌的分離與脂肪酸鑒定[J].亞熱帶植物科學(xué)，2008，37（4）：22-25.

[15] 朱 宇，鄭 琳，劉煜宇，等.西瓜內(nèi)生菌的揮發(fā)性成分分析及其發(fā)酵香料在卷煙中的應(yīng)用[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（4）：2093-2097.

[16] 周麗娟，鄭 琳，劉煜宇，等.荔枝產(chǎn)香內(nèi)生菌的揮發(fā)性成分分析及其在卷煙中的應(yīng)用研究[J].精細(xì)化工，2010，27（10）：1013-1015，1030.

[17] 王卓仁.組織分離法在食用菌選擇育種中的原則與實(shí)踐[J].中國食用菌，2008，27（4）：12-13.

[18] 徐永健，樂觀宗，張友平.龍須菜體表附生細(xì)菌的幾種分離方法比較[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（1）：123-126.

[19] 周宏偉，吳錦雅.不同富集方法分離多環(huán)芳烴降解菌的比較研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7（9）：1308-1309，1312.

[20] 王 超，陳啟和，倪 輝，等.1株枯草芽胞桿菌的鑒定及其彈性蛋白酶結(jié)構(gòu)研究[J].微生物學(xué)雜志，2012，32（3）：13-20.

[21] 李 娟，白逢彥.26S rDNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析在臨床酵母菌菌種鑒定中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2009，49（8）：1011-1017.

[22] 匡 鈺.優(yōu)良菠蘿果酒酵母的選育及其在菠蘿果醋發(fā)酵中的應(yīng)用研究[D].廣東湛江：廣東海洋大學(xué)，2012.

[23] 胡月英.菠蘿酒酵母的分離、篩選及釀造工藝研究[D].海口：海南大學(xué)，2010.

[24] 王鵬霄.4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[D].北京：北京工商大學(xué)，2010.

[25] 甄達(dá)文，于鐵妹，朱珊珊，等.利用酶法與微生物發(fā)酵法制備天然煙用香料[J].食品工業(yè)科技，2009（12）：268-272.

[26] 袁 麗.鴨梨酒酵母菌的選種研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[27] 張雪梅.四川香腸生產(chǎn)過程中理化特性、微生物特性及產(chǎn)香葡萄球菌的篩選與應(yīng)用[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[28] 王 剛，邢家溧，印伯星，等.泡菜、豆醬中產(chǎn)香酵母菌的篩選及其在面包制作中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2014（23）：155-160.

[29] 李 文，姜先榮，姚建銘.香料生產(chǎn)的研究進(jìn)展與展望[J].生物學(xué)雜志，2007，24（2）：44-46.

[30] 歐陽杰，韋立強(qiáng)，武彥珍，等.利用生物技術(shù)方法生產(chǎn)天然香料香精[A].2006年中國香料香精學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].2006.72-75.