趙 晰 ，楊熙凱 ，王耀光，李 蔓

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3.天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥之一[1]，研究發(fā)現(xiàn)多種腎臟局部生長(zhǎng)因子均與DN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等，它可以刺激腎系膜細(xì)胞增殖、系膜外基質(zhì)沉積增加，因此，認(rèn)為其在DN發(fā)病中可能起著關(guān)鍵性作用[2]。DN的另一個(gè)重要病理機(jī)制是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；上皮細(xì)胞受損后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，形成其他類型的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到腎間質(zhì)后分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，加速DN的病理進(jìn)程[3]，因此推測(cè)，通過抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，可以間接解釋腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的問題。

同時(shí)氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是DN的發(fā)病中心環(huán)節(jié)，血紅素氧合酶-1（HO-1）是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程一個(gè)非常敏感的指標(biāo)。糖尿病時(shí)，腎臟組織HO-1可被顯著誘導(dǎo)，起到抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗炎癥反應(yīng)的作用[4]。

目前對(duì)DN的治療，主要是積極治療并發(fā)癥，保護(hù)腎功能和綜合治療，但對(duì)腎臟病進(jìn)展的影響尚不清楚，對(duì)此中醫(yī)藥在治療DN方面顯示出了明顯的優(yōu)勢(shì)[5]，本課題組近年來在臨床上發(fā)現(xiàn)活血化瘀法糖腎方在治療DN上取得了很好的效果，展示出了良好的腎臟保護(hù)作用。本研究旨在探討糖腎方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）、HO-1 表達(dá)的干預(yù)；闡明糖腎方延緩腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床防治DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑 FORMA3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司；ALPHA細(xì)胞培養(yǎng)基（批號(hào)：C12571500BT），gibco公司；胎牛血清（批號(hào) sv30087.03），HyClone 公司；胰蛋白酶 1∶250（Genview，貨號(hào)：GP3108）；4-甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Beyotime，貨號(hào)/批號(hào)：C0009/081817171103）；HO-1、TGF-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體，均為Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與細(xì)胞 糖腎方（黃芪30 g，白術(shù)15 g，丹參 30 g，生地 12 g，山藥 30 g，防風(fēng) 15 g，防己 15 g，川芎 12 g，萆薢 15 g，石菖蒲 15 g，鬼箭羽15 g，地龍12 g），天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國醫(yī)堂提供，用時(shí)旋蒸濃縮，批號(hào)：2018002；人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）：購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備含藥血清 SPF級(jí)SD大鼠12只，雄性，體質(zhì)量（210±10）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，普通飼料喂養(yǎng)。

將大鼠隨機(jī)分為空白組、糖腎方低濃度組、糖腎方高濃度組，每組4只。按照成人臨床用藥劑量計(jì)算，糖腎方高濃度組中藥9 g/kg灌胃，糖腎方低濃度組1.8 g/kg灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水。每次10μL/g，上、下午各1次，灌胃3 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃30 min后大鼠股動(dòng)脈采血，靜置2 h后3 000 r/min冷凍離心20 min，取上清，-20℃保存，用時(shí)與培養(yǎng)基配成所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞傳代 HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM ALPHA培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔1～2 d換新鮮培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）的消化液消化后傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h同步細(xì)胞，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞分為5組：1）空白對(duì)照組：MEMALPHA培養(yǎng)基。2）高糖組：MEMALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖。3）空白血清組：MEMALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清。4）糖腎方低劑量血清組：MEMALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%低劑量含藥血清。5）糖腎方高劑量血清組：MEM ALPHA培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10%高劑量含藥血清。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 待HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%左右時(shí)，使用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，按每孔100μL常規(guī)培基3 000左右個(gè)細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，種植于96孔培養(yǎng)板上，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，板周邊孔用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）填充，留空白孔調(diào)零，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)基每孔100μL培養(yǎng)，同步24 h；吸棄培養(yǎng)基，按以下分組加入藥物，實(shí)驗(yàn)分4組：空白血清組（10%正常大鼠血清）；高糖組（30 mmol/L葡萄糖）；糖腎方低劑量血清組（30 mmol/L葡萄糖+10%低劑量含藥血清）；糖腎方高劑量血清組（30 mmol/L葡萄糖+10%糖腎方高劑量含藥血清），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加20μl MTT溶液（5 mg/mL）培養(yǎng) 4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）溶液 150μL，培養(yǎng)10 min，酶標(biāo)儀上測(cè)其吸光度值（A490nm）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/空白對(duì)照組A值×100%。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 細(xì)胞培養(yǎng)后，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行收集，用Trizol提取細(xì)胞樣本中總RNA，之后將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取產(chǎn)物以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。各指標(biāo)引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行軟件分析。

表1 目的基因引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小Tab.1 Objective gene primer sequence and size of amplification product

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)各組腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1、HO-1、α-SMA蛋白的表達(dá)。

1.2.7 圖像分析 采用Image J分析軟件對(duì)Western blot圖像進(jìn)行分析。見圖1。

圖1 各組目的蛋白表達(dá)水平Fig.1 Levels of target protein in each group

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，圖像分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞形態(tài) 正常腎小管上皮細(xì)胞呈圓形或多邊形，鏡下呈“鋪路石”樣，高糖誘導(dǎo)下，腎小管上皮細(xì)胞失去固有形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，核也呈梭形改變。結(jié)果見圖2。

圖2 細(xì)胞形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes

2.2 MTT法結(jié)果 與空白血清組比較，高糖組吸光度值明顯增高（P＜0.05）；與高糖組比較，糖腎方高、低劑量血清組在培養(yǎng)24 h后吸光度值均有下降，吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且糖腎方高劑量血清組吸光度值下降強(qiáng)于糖腎方低劑量血清組（P＜0.05）。糖腎方高劑量血清組抑制率最高。見表2。

2.3 TGF-β1與α-SMA mRNA的表達(dá) 高糖組與空白對(duì)照組相比較，高糖組腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1以及 α-SMA mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01）；空白血清組與高糖組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎方低劑量血清組以及糖腎方高劑量血清組中TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），且糖腎方血清高、低劑量血清組間比較，在降低TGF-β1方面，糖腎方高劑量血清組效果最優(yōu)（P＜0.05）；兩組在降低α-SMA方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 4。

表2 糖腎方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effect of Tangshen prescription-containing serum on high glucose-induced HK-2 cell proliferation

2.4 HO-1 mRNA的表達(dá) 高糖組與空白對(duì)照組相比較，高糖組中的HO-1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；空白血清組與高糖組相比，差異沒有意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎方低劑量血清組以及糖腎方高劑量血清組中HO-1的mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），且兩劑量組在效果上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組HK-2細(xì)胞目的蛋白mRNA的表達(dá)Tab.3 The mRNA expression of HK-2 cells in each group

表3 各組HK-2細(xì)胞目的蛋白mRNA的表達(dá)Tab.3 The mRNA expression of HK-2 cells in each group

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05。

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2.5 TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá) 高糖組與空白對(duì)照組相比較，高糖組腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1以及α-SMA蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；空白血清組與高糖組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎方低劑量血清組以及糖腎方高劑量血清組中 TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），且糖腎方高低劑量血清組間比較，在降低TGF-β1方面，糖腎方高劑量血清組效果最優(yōu)（P＜0.05）；兩組在降低α-SMA方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表4。

2.6 HO-1蛋白表達(dá) 高糖組與空白對(duì)照組相比較，高糖組中的HO-1蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；空白血清組與高糖組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與高糖組相比，糖腎方低劑量血清組以及糖腎方高劑量血清組中HO-1的mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），且兩劑量組在效果上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組HK-2細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)Tab.4 The expression of target protein in HK-2 cells

表4 各組HK-2細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)Tab.4 The expression of target protein in HK-2 cells

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05；與高糖組對(duì)比，#P＜0.05；與糖腎方低劑量血清組比較，△P＜0.05。

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3 討論

DN是最常見的微血管并發(fā)癥之一，大約有30%的糖尿病患者發(fā)展為DN，是導(dǎo)致終末期腎臟病主要原因之一[6]。

TGF-β1在腎纖維化中占有很重要的地位，如TGF-β1/Smad、TGF-β1/P38MAPK 等[7-9]。α-SMA 是腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征性蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)合成的主要來源，并可通過α-SMA降低表達(dá)，來緩解腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程[10]。

目前抗氧化劑治療DN成為臨床研究熱點(diǎn)[11]，HO-1是一種拮抗氧化應(yīng)激的抗氧化酶，也是氧化應(yīng)激過程中一個(gè)非常敏感的指標(biāo)，腎臟損傷可能由于HO-1的缺失，導(dǎo)致TGF-β的高表達(dá)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重了腎間質(zhì)纖維化[9，12]。病理狀態(tài)下，如糖尿病時(shí)，腎臟組織中體外氯自由基（ROS）明顯增多，HO-1被誘導(dǎo)，而且HO-1還可能通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，起到抗纖維化抗炎癥反應(yīng)的作用[13]，急性腎損傷時(shí)，HO-1基因敲除的小鼠，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）增加。

在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)的增多，糖腎方的含藥血清能有效抑制TGF-β1導(dǎo)致的EMT，同時(shí)還可上調(diào)HO-1表達(dá)，糖腎方可誘導(dǎo)HO-1發(fā)生抗氧化作用，這在課題組的研究中得到了證實(shí)。因此，推測(cè)糖腎方含藥血清能抑制TGF-β1可能和其抗氧化機(jī)制存在相關(guān)性，表明糖腎方含藥血清可上調(diào)HO-1表達(dá)，下調(diào)TGF-β1表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)纖維化，保護(hù)腎臟功能。

本實(shí)驗(yàn)所用糖腎方為王耀光教授臨床經(jīng)驗(yàn)用藥，王教授認(rèn)為腎纖維化，其病機(jī)應(yīng)屬“本虛標(biāo)實(shí)”，故糖腎方以扶正祛邪為主，方中黃芪補(bǔ)中益氣、實(shí)衛(wèi)固表為主藥；白術(shù)補(bǔ)氣健脾祛濕，防風(fēng)、防己祛風(fēng)勝濕兩藥合用，生地、山藥脾腎同補(bǔ)，共為臣藥；川芎、丹參、鬼箭羽活血化瘀為佐藥；地龍活血消癥，直達(dá)腎絡(luò)，萆薢、石菖蒲利濕化濁共為佐使。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24 h高糖誘導(dǎo)下的腎小管上皮細(xì)胞增殖活躍。與空白血清組對(duì)比，HK-2細(xì)胞在高糖刺激后，細(xì)胞外基質(zhì)成分TGF-β1、α-SMA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HO-1含量上升，用糖腎方含藥血清干預(yù)后，TGF-β1、α-SMA 的含量開始下降，HO-1開始升高，與高糖組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明糖腎方在一定程度上起到了減輕細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積、減輕細(xì)胞損傷、抑制腎間質(zhì)纖維化的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1和α-SMA蛋白呈現(xiàn)高水平表達(dá)，HO-1一定程度升高。糖腎方含藥血清可以降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞蛋白TGF-β1、α-SMA表達(dá)并且升高HO-1蛋白表達(dá)水平，糖腎方對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。因此，糖腎方可以通過抑制細(xì)胞增殖和HO-1、TGF-β1，逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程，抑制DN腎間質(zhì)纖維化，延緩病情進(jìn)展。

（收稿日期：2018-04-15）