劉婷婷,盧春霞

(1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆石河子 832000;2.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,重慶 408100)

大黃為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(Rheum)多年生草本,可分為掌葉大黃(R.palmatumL)、唐古特大黃(R.palmatumMaxim.ex Balf.)和藥用大黃(R.officinaleBaill),以根及根狀莖入藥,其性味苦、寒,具有瀉下清熱、涼血解毒、活血祛瘀等功效[1]?，F(xiàn)代中藥化學(xué)研究證明,大黃主要含有蒽醌衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、有機酸、花青素類、多糖等化學(xué)成分,其中,蒽醌衍生物(大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等)被認(rèn)為是主要的活性成分,具有抗菌抗病毒[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、保肝[5]、抗腫瘤[6]等藥理作用。因此,蒽醌化合物經(jīng)常作為控制中藥大黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一[7]。

目前,對大黃蒽醌的提取多采用傳統(tǒng)的有機溶劑萃取及堿溶液沉淀等[8-9],這種傳統(tǒng)的技術(shù)費時、費力,需要損耗大量揮發(fā)性有機溶劑。離子液體(Ionic Liquids,ILs)由于具有獨特的理化性能和良好的溶解能力,近些年在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用逐漸增多[10-12]。然而,由于ILs低的蒸氣壓,如何除去提取物中ILs殘留仍然是急待解決的問題。

大孔吸附樹脂可通過靜電引力(表面范德華力)、氫鍵相互作用等從極性溶劑和非極性溶劑中吸附目標(biāo)物質(zhì)[13]。由于具有吸附性強、成本低、容易再生、耗溶劑少等優(yōu)點,經(jīng)常被用于天然產(chǎn)物的分離和純化[14-15]。徐晶等[16]采用X-5型大孔樹脂富集純化大黃提取物中5種蒽醌,5種蒽醌的含量由1.16%提高到2.66%。葉殷殷等[17]比較6種大孔樹脂對大黃5種蒽醌的吸附性能,其中DM130型樹脂分離能力最強,吸附量達(dá)到18.78 mg/g,解吸附率為95.38%。李倩[18]利用離子液體[bmim]Br的水溶液提取葛根總黃酮,然后利用大孔樹脂分離純化葛根素,使其含量提高了8.93%,并實現(xiàn)了目標(biāo)物與離子液體提取溶劑的有效分離。因此,本研究擬采用離子液體溶液提取大黃蒽醌,大孔樹脂分離純化5種蒽醌化合物(大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚),同時除去提取物中殘留的離子液體,為蒽醌類化合物的分離純化及離子液體殘留的去除提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃 本地中草藥店;蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(純度>99%) 上海同田生物技術(shù)有限公司;離子液體1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([bmim]Br)(純度>99%) 中科院蘭州物理化學(xué)研究所綠色化學(xué)與催化中心;HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7、ADS-17型號大孔樹脂 滄州寶恩化工有限公司和南開大學(xué)化工廠和西安藍(lán)曉科技有限公司;甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;SHZ-82A 水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠;BSA224S-CW天平 德國 Sartorius 公司;TU-1901紫外分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 美國Waters公司;MS3 basic渦旋混合器 德國IKA公司;R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士步琦公司;KQ-500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng) 成都超純科技有限公司;ZK-82B真空干燥箱 上海市實驗儀器廠;φ2.0 cm×50 cm玻璃層析柱 上海廈美生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液配制 稱取大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚對照品各5.0、12.5、30、5.5、13.4 mg,用甲醇定容至50 mL,4 ℃避光保存。

1.2.2 蒽醌及離子液體的測定條件 5種蒽醌化合物及離子液體[bmim]Br的測定條件參考Lu報道的方法[12,19]。

色譜條件:色譜柱(Acquity UPLCTM BEH C18柱,100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫:40 ℃;流動相:(A)乙腈,(B)0.1%的甲酸溶液,梯度洗脫11 min內(nèi)流動相由30A/70B變?yōu)?00A/0B;流速:0.3 mL/min;檢測器:DAD;檢測波長:280 nm,掃描范圍:200～600 nm;進樣量:0.5 μL。

質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧電離(ESI-),毛細(xì)管電壓:3.0 kV,錐孔電壓:24 V,離子源溫度:100 ℃,脫溶劑氣溫度:400 ℃,碰撞能量:6 eV,反溶劑氣流:500 L/h,質(zhì)量范圍:100～1000 m/z。

1.2.3 大黃提取液的制備 參考文獻(xiàn)[12]對大黃中蒽醌化合物進行提取。大黃樣品50 ℃條件下干燥10 h,中藥粉碎機進行粉碎,過60目篩,準(zhǔn)確稱量大黃粉末11.6 g,置于圓底燒瓶中,添加2.0 mol/L的[bmim]Br提取溶液,料液比為1∶15 (g/mL),采用超聲微波協(xié)同提取法提取蒽醌類化合物,微波功率為500 W,提取時間為2 min。重復(fù)提取2次,合并提取液,抽濾除去濾渣,收集上清液,濃縮、定容至200 mL,UPLC-MS/MS測定5種蒽醌的含量。提取液中5種游離蒽醌總濃度為 4.16 mg/mL,避光、4 ℃保存,供大孔樹脂分離純化時使用。

1.2.4 大孔樹脂的預(yù)處理 大孔樹脂首先用95%的乙醇浸泡24 h,然后將樹脂裝入層析柱,用95%的乙醇淋洗,至流出的液體不再渾濁為止,再用蒸餾水洗凈至無乙醇。

1.2.5 靜態(tài)吸附與解吸實驗 分別取預(yù)處理過的不同型號(HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7和ADS-17)的樹脂各5 g,置于錐形瓶中,加入大黃提取溶液20 mL,于120 r/min的搖床中進行靜態(tài)吸附10 h,取上清液,測定5種蒽醌含量。樹脂傾出吸附液后,先用蒸餾水沖洗,然后用95%的乙醇在搖床中解吸10 h,測定其解吸液中的蒽醌濃度,每個實驗重復(fù)操作3次。按以下公式計算各種樹脂的吸附量、吸附率和解吸率:

式(1)

式(2)

式(3)

式(1)中:Qe為平衡吸附量(mg/g),C0為原液中5種蒽醌總濃度(mg/mL),Ce為吸附平衡后溶液中5種蒽醌總濃度(mg/mL),Vi為溶液的體積(mL),W為樹脂重量(g);式(2)中:E為吸附率(%),其他同式(1);式(3)中:D為解吸率(%),Cd為解吸液濃度(mg/mL),Vd為解吸液體積(mL),其他同式(1)。

1.2.6 靜態(tài)吸附等溫線的繪制 將提取溶液稀釋,使5種蒽醌總濃度分別為0.52、1.56、2.60、3.12、3.64、4.16 mg/mL,稱取預(yù)處理過的HPD-100樹脂5.0 g,分別加入上述稀釋的溶液中,在不同溫度下(25、30、35 ℃),置于120 r/min的水浴恒溫振蕩器中,靜態(tài)吸附10 h,之后分別測定上清液中5種蒽醌含量(Ce),計算吸附量(Qe),以平衡吸附量對平衡濃度作圖得靜態(tài)吸附等溫線。每個實驗重復(fù)操作3次。

1.2.7 吸附動力學(xué)實驗 準(zhǔn)確稱取HPD-100大孔樹脂5.0 g,分別置于50 mL具塞錐形瓶中,加入20 mL提取液(5種蒽醌總含量3.64 mg/mL),于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振搖吸附,分別間隔10、20、40、80、120、160、200 min取上清液,UPLC-MS/MS法測定5種蒽醌含量。每個實驗重復(fù)操作3次。

1.2.8 動態(tài)吸附和解吸條件的確定 取50 mL(26.3 g)預(yù)處理過的HPD-100大孔樹脂濕法裝柱。吸取一定體積的提取液(5種蒽醌總含量為3.64 mg/mL)上柱,以一定的流速過層析柱,動態(tài)吸附平衡后,用蒸餾水淋洗,用一定濃度的乙醇溶液解吸目標(biāo)物。實驗中采用UPLC-MS/MS測定流出液和洗脫液中5種蒽醌含量。分別對徑高比(1∶5、1∶8、1∶12)、上樣流速(1.0、1.5、2.0 BV/h)、上樣體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0BV)、洗脫液濃度(乙醇溶液75%、85%、95%)和洗脫體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 BV)等動態(tài)吸附和解吸條件進行優(yōu)化,確定最佳條件。每個實驗重復(fù)操作3次。

1.2.9 優(yōu)化工藝條件的驗證 在優(yōu)化條件下對大黃蒽醌進行吸附和解吸,并計算其吸附率、解吸率,提取物中5種蒽醌含量、純化后5種蒽醌含量和總回收率。同時,利用UPLC-MS/MS技術(shù)來檢測提取物中的離子液體是否去除。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇

不同型號大孔樹脂對大黃5種蒽醌的靜態(tài)吸附結(jié)果見表1。由表1可知,HPD-100、XDA-6和AB-8樹脂對5種蒽醌的吸附性能優(yōu)于其余三種極性樹脂,其中HPD-100樹脂對5種蒽醌的吸附能力最強,吸附率為81.1%,解析率為83.8%。HPD-100樹脂表現(xiàn)出較高的吸附特性可能與其較大比表面積有關(guān),并和溶質(zhì)有著相似的極性有關(guān)。因此,選擇非極性樹脂HPD-100用于大黃5種蒽醌的純化。

表1 不同型號大孔樹脂對大黃5種蒽醌的吸附性能比較

2.2 靜態(tài)吸附等溫線

HPD-100大孔樹脂對5種蒽醌的吸附等溫線見圖1。如圖1所示,隨著溫度的升高,5種蒽醌在樹脂上的總吸附量均減少,在25 ℃時吸附量達(dá)到最大,說明吸附行為為放熱過程。同時,5種蒽醌在樹脂上的總吸附量隨著濃度的升高而升高,當(dāng)5種蒽醌總濃度達(dá)到3.64 mg/mL時,吸附量增加趨勢變緩,即趨于飽和,最大結(jié)合量為13.5 mg/g。因此,后續(xù)實驗選擇上樣總濃度(5種蒽醌)為3.64 mg/mL,吸附溫度25 ℃。

圖1 不同溫度下5種蒽醌化合物在HPD-100樹脂上的靜態(tài)吸附等溫線

2.3 吸附動力學(xué)

圖2為HPD-100大孔樹脂對大黃5種蒽醌的吸附動力學(xué)曲線,5種蒽醌在HPD-100樹脂上的總含量隨時間增加而增加,在60 min以前,吸附量呈持續(xù)上升趨勢,約在60 min時達(dá)到吸附平衡,隨后吸附量隨著時間的延長無明顯變化。

圖2 HPD-100樹脂對蒽醌化合物吸附動力學(xué)曲線

2.4 動態(tài)吸附和解吸條件優(yōu)化

2.4.1 徑高比對吸附能力的影響 高的徑高比使得被吸附溶質(zhì)和柱床有長的接觸時間,有利于吸附;相反徑高比越低,意味著質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率越低,溶質(zhì)和吸附劑接觸時間短,也就容易發(fā)生泄露。本實驗研究了不同徑高比對大黃5種蒽醌的吸附效果,采用85%的乙醇作為洗脫溶劑,結(jié)果見圖3。由圖3可知,隨著徑高比的增加,5種蒽醌的總吸附量明顯增加;當(dāng)徑高比為1∶8時,這種增加趨勢明顯變緩,表明吸附接近飽和。由于大的徑高比會導(dǎo)致柱壓上升,因此,層析柱徑高比選擇1∶8。

圖3 徑高比對5種蒽醌吸附能力的影響

2.4.2 上樣體積和流速對吸附能力的影響 溶質(zhì)分子在樹脂上的吸附是一個平衡過程,流速越慢,溶質(zhì)有充裕的時間擴散到吸附劑的活性位點上;反之則容易發(fā)生泄露,從而降低柱的動態(tài)吸附量。不同流速的上樣溶液的動態(tài)吸附曲線見圖4。由圖4可知,隨著上樣流速的增加,蒽醌動態(tài)吸附的泄露點均逐漸提前,在1.0 BV/h的流速下,蒽醌在2.5 BV時開始泄露。因此,選擇上樣溶液體積為2.0 BV,流速為1.0 BV/h。

圖4 蒽醌在不同加樣流速下的動態(tài)吸附曲線

2.4.3 洗脫液的選擇 洗脫液對解吸率有著一定的影響,本實驗基于蒽醌溶解性及產(chǎn)品安全性考慮,選用經(jīng)濟、低毒的乙醇溶液作為洗脫溶劑。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的洗脫效果見圖5。由圖5可知,5種蒽醌的總解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,但差異不明顯,綜合考慮解吸率和經(jīng)濟效益,選擇85%的乙醇溶液作為洗脫溶劑。

圖5 乙醇濃度對5種蒽醌化合物解吸能力的影響

2.4.4 洗脫曲線的考察 為了獲得高的解吸率和消耗盡量少的溶劑,實驗在上述優(yōu)化條件下采用不同體積的乙醇溶液(85%)洗脫層析柱,測定洗脫液中5種蒽醌的含量,繪制洗脫曲線(圖6)。由圖6中可知,乙醇用量為3.0 BV時,5種蒽醌化合物基本洗脫完全。故選擇的乙醇洗脫體積為3.0 BV。

圖6 5種蒽醌在HPD-100樹脂上的洗脫曲線

2.5 工藝條件驗證

采用上述最佳優(yōu)化條件對5種蒽醌化合物進行分離純化,結(jié)果見表2。由表2可知,在初步富集后,5種蒽醌的總含量從粗提物的7.13%增加為20.5%,總回收率為98.7%。五種蒽醌化合物經(jīng)HPD-100樹脂純化前后的色譜圖見圖7。由色譜圖可知,蒽醌粗提物經(jīng)一次分離純化后,一些雜質(zhì)峰面積明顯變小,5種蒽醌化合物得到了有效富集,提取物中殘留的離子液體[bmim]Br被去除。

表2 最佳條件下5種蒽醌在HPD-100樹脂上的純化結(jié)果(n=3)

圖7 大黃提取物分離純化前后的色譜圖

3 結(jié)論

本實驗研究了6種大孔吸附樹脂(HPD-100、XDA-6、AB-8、LX-38、ADS-7和ADS-17)對大黃5種蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)的吸附-解吸效果,對最優(yōu)大孔樹脂下的動態(tài)吸附特性進行了初步研究。結(jié)果表明,HPD-100 樹脂吸附和解吸率最為理想;篩選得到大黃5種蒽醌分離純化的優(yōu)化條件為:層析柱徑高比為1∶8,上樣溶液5種蒽醌總含量為 3.64 mg/mL,上樣流速 1.0 BV/h,上樣體積為2.0 BV,85%的乙醇為洗脫溶液,洗脫流速 1.0 BV/h,洗脫體積為3.0 BV。經(jīng)該工藝純化后,5種蒽醌總含量由原來粗提物中的7.13%提高到20.5%,是原來的2.88倍。同時,提取物中殘留的[bmim]Br被除去,表明本實驗選擇的優(yōu)化條件具有可行性。