薛曉曉，秦 棟，霍俊偉，劉慶帥，劉化禹，謝佳璇，孫小娟，員盎然

（東北農業(yè)大學園藝園林學院，150030）

藍果忍冬（Lonicera caerulea L.）為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）的一種新興小漿果，俗稱藍靛果，我國大小興安嶺、長白山山區(qū)蘊含豐富的野生資源。其果實富含花色苷類、黃酮類以及多酚類等生物活性物質，氨基酸，糖類，有機酸，礦物質等營養(yǎng)物質，因此具有較高的營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值，可以預防癌癥，心血管，神經(jīng)性，糖尿病等疾病[6]。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

以2個引自俄羅斯的鮮食品種“邱雷姆”和“娜雷姆”為試材，MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)30d，取無菌苗中上部葉片，接種時在葉片正面橫切幾刀形成劃痕，葉片背面接觸培養(yǎng)基，接種到添加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH為5.8，附加不同生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基，于人工氣候室暗培養(yǎng)相應時間后轉移至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)40天后調查結果。暗培養(yǎng)條件為濕度75%，溫度25±1℃。

1.2 試驗處理及方法

1.2.1 單一植物生長調節(jié)劑誘導葉片愈傷組織

以兩品種的無菌苗葉片為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，選用6-BA、2，4-D、TDZ、ZT和CPPU五種激素設計成單因素試驗，濃度均為0.5、1.0、2.0mg/L。暗處理15天后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40天后調查愈傷組織誘導情況。

1.2.2 兩種植物生長調節(jié)劑組合誘導葉片愈傷組織

選用6-BA和2，4-D激素組合，TDZ和ZT激素組合，設計成兩個復因素試驗：暗處理15天后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40天后調查愈傷組織誘導情況。

6-BA設兩個水平：1.0、2.0mg/L，2，4-D設三個水平：0.2、0.5、1.0mg/L設計成6個水平組合的完全隨機試驗。

TDZ設兩個水平：1.0、2.0mg/L，ZT設三個水平：0.1、0.3、1.0mg/L設計成6個水平組合的完全隨機試驗。

1.2.3 三種植物生長調節(jié)劑組合誘導葉片愈傷組織

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5、1.0、1.5mg/L），IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）和KT（0.5、1.0、1.5mg/L），采用三因素三水平正交設計，按照L9（34）前三列安排試驗，共9個處理組合（表1）。暗處理35天，統(tǒng)計出愈率，褐化率，觀察愈傷組織狀態(tài)。

表1 藍果忍冬葉片愈傷組織誘導正交設計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

出愈率（%）=愈傷組織數(shù)/外植體數(shù)×100，褐化率（%）=褐化葉片數(shù)/外植體數(shù)×100

所有試驗均重復3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖用SPSS19. 0 和 Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 添加兩種植物生長調節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導的影響

不同生長調節(jié)劑組合對藍果忍冬葉片愈傷組織的誘導效果也不同。6-BA與2，4-D各個組合均能有效誘導葉片產生愈傷組織，但TDZ和ZT組合的誘導率極低，僅使邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷且呈黃棕色，易褐化（見圖1-J）。

6-BA與2，4-D組合的各處理誘導率均可達100%，且愈傷組織多呈綠色、黃綠色、深綠色或淡黃色，表面有瘤狀突起，顆粒狀，質地緊實，愈傷量多，愈傷組織生長快，無褐化（見圖1A-F）。這與單獨添加2，4-D誘導的愈傷組織有差異，可能是細胞分裂素與生長素相互作用的結果。各處理的愈傷量略有差異，當6-BA濃度為1.0mg/L時，邱雷姆葉片愈傷量隨2，4-D濃度升高而增多，娜雷姆愈傷量則先增多后減少，在2，4-D濃度0.5mg/L時愈傷量達到最多，但少于邱雷姆。6-BA濃度為2.0mg/L時，兩品種都是在2，4-D濃度0.5mg/L時達到最大愈傷量。各處理的娜雷姆愈傷量普遍少于邱雷姆，這可能是由品種差異所致。

表2 6-BA 與2，4-D組合對葉片愈傷組織誘導的影響

表3 TDZ與ZT組合對葉片愈傷組織誘導的影響

圖1 兩種生長調節(jié)劑組合誘導的愈傷組織

（A-F）6-BA+2，4-D誘導葉片愈傷組織；（A）愈傷啟動；（B）光下轉綠；（C-F）愈傷組織逐漸長大為深綠色致密型；（J、H）TDZ2.0mg/L+ZT1.0mg/L誘導的愈傷組織；（I）TDZ2.0mg/L+ZT0.3mg/L誘導的愈傷組織。

2.2 添加三種植物生長調節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導的影響

三種調節(jié)劑6-BA、IBA、KT的9種組合處理對藍果忍冬不同品種葉片愈傷組織的誘導效果不同（表4），方差分析表明，影響邱雷姆葉片愈傷組織誘導的主次因素為IBA＞6-BA＞KT，而影響娜雷姆葉片愈傷組織誘導的主次因素為KT＞IBA＞6-BA（表5，6）；兩品種有所差異，這可能與不同品種對細胞分裂素的敏感性有關；MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+KT0.5mg/L（處理6）對兩品種的誘導率均達到95%以上，可以作為通用的體系。

三種調節(jié)劑組合各處理誘導的愈傷組織形態(tài)基本相同，都為黃色顆粒狀，質地較硬（圖2）。結合表4和圖2，不論是從誘導率還是愈傷量、褐化狀況考慮，邱雷姆的誘導效果均好于娜雷姆，這可能與品種差異有關。

2.3 三種不同添加方式對藍果忍冬葉片愈傷組織誘導的比較

通過圖1、圖2愈傷組織形態(tài)對比以及表2、表4的數(shù)據(jù)對比，不同方案的愈傷組織誘導效果不同。添加單一的生長調節(jié)劑，2，4-D是誘導藍果忍冬葉片產生愈傷組織最有效的物質，濃度范圍0.5-2.0mg/L均有效，6-BA、TDZ、ZT、CPPU效果不好。

添加兩種調節(jié)劑處理好于單一調節(jié)劑處理，雖然2，4-D處理各濃度下出愈率都為100%，但愈傷組織質地多為淡黃色或綠色水漬狀，較軟，而2，4-D和6-BA配合處理下愈傷組織顏色多為綠色顆粒狀，質地緊實致密，有利于后期培養(yǎng)和不定芽誘導，且愈傷量也多于2，4-D單獨處理。

表4 6-BA、IBA、KT組合對葉片愈傷組織誘導的影響

表5 娜雷姆葉片愈傷誘導率結果方差分析

表6 邱雷姆葉片愈傷誘導率結果方差分析

圖2 三種生長調節(jié)劑組合誘導的愈傷組織

6-BA、IBA、KT三種調節(jié)劑組合誘導率低于2，4-D和6-BA配合處理，且愈傷啟動時間長，愈傷組織生長慢，該方案兩個品種的誘導效果差異很大，娜雷姆誘導率低，最低為處理4的59%（表4）。愈傷量很少且褐化率高（圖2-F），邱雷姆愈傷量很多（圖1A-C），與單獨添加2，4-D以及添加6-BA和2，4-D組合處理誘導的愈傷量相當，但質地更為緊實不易碎，相反6-BA和2，4-D組合處理則更加松脆（圖2）。

3 討論

藍果忍冬是極具開發(fā)前途的小漿果，但目前品種及優(yōu)良苗木缺乏。研究藍果忍冬的組織培養(yǎng)不但能提高苗木擴繁速度，更能加快品種選育進程，具有很大的實踐意義

在各種植物的愈傷組織誘導中，使用最多的是2，4-D。早熟禾種子單獨添加2，4-D即可誘導產生愈傷組織，1.0mg/L～2.0mg/L誘導效果較好，0.1或0.2mg/L 2，4-D與3mg/L 6-BA組合的誘導效果明顯好于2，4-D單獨處理，本試驗具有類似的結果，邱雷姆和娜雷姆分別在2，4-D濃度1.0和2.0mg/L時誘導效果最好，且6-BA與2，4-D組合處理好于2，4-D單獨處理。

一般高濃度2，4-D不利于愈傷組織誘導分化，黑果枸杞愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS＋2，4-D2.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，愈傷組織分化培養(yǎng)基為 MS＋2，4-D1.0mg/L＋6-BA 0.5mg/L，即低濃度2，4-D利于分化，本研究娜雷姆在2，4-D濃度0.5mg/L時，愈傷組織更為致密，有利于愈傷組織的進一步分化。單獨使用6-BA不能誘導杜仲葉片產生愈傷組織，6-BA與生長素NAA配合使用可誘導出較好的愈傷組織，本研究結果也表明單獨添加6-BA的葉片愈傷組織誘導率為0，但與生長素2，4-D結合效果很好，表明細胞分裂素類和生長素類配合使用的愈傷組織誘導效果好于單獨使用生長素類。

單獨添加細胞分裂素6-BA、TDZ、CPPU均能誘導毛桃葉片產生愈傷組織，1.0mg/L CPPU也能有效誘導苧麻葉片產生愈傷組織并再生不定芽。1.0mg/L ZT可誘導矮叢藍莓莖段直接器官再生，5.0mg/L ZT可誘導外植體通過愈傷組織途徑再生。本研究結果表明CPPU、TDZ、ZT雖然具有高活性，但對藍果忍冬葉片愈傷組織誘導效果不好，原因可能與物種不同有關。TDZ和ZT組合使蔓越橘莖段離體再生頻率能達到60%。本研究表明該組合效果不好，不適用于藍果忍冬的離體誘導及再生。

金鐵鎖上的研究表明在6-BA與生長素NAA組合的基礎上添加KT，帶芽莖段的出愈率和芽叢分化率均高達100%，本研究采用6-BA、2，4-D、KT組合處理時兩品種的誘導率均在60%以上，且邱雷姆在大部分處理下的誘導率為100%，證明KT對藍果忍冬愈傷組織誘導效果顯著，值得在今后的試驗中進一步研究。

利用葉片進行愈傷組織誘導具有取材廣，效率高的特點，可提高苗木快繁效率，是離體再生體系的建立的基礎；本試驗只是對不同生長調節(jié)劑對葉片愈傷組織的誘導進行了初步研究，由愈傷組織到可在市場利用的完整植株還需經(jīng)過愈傷組織分化不定芽以及生根培養(yǎng)，煉苗移栽等多項環(huán)節(jié)，因此藍果忍冬的組培快繁體系的建立還需要進一步研究。