鄧菊紅 范翔雪 陶 然 宋啟琴 孔紅言 焦云桃 黃加權(quán)△

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院內(nèi)科 (湖北 武漢， 430077 ) 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科

肝星狀細(xì)胞(HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，在HSCs激活和肝纖維化過程中, 轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用[2]。microRNA29b(miR-29b)是新近發(fā)現(xiàn)的一類與纖維化疾病密切相關(guān)的小分子RNA家族成員之一。諸多研究發(fā)現(xiàn)miR-29b可通過直接抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和調(diào)控多種信號通路參與纖維化過程[3,4]。在肝纖維化過程中,不僅miRNAs可作用于TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響TGF-β1發(fā)揮作用,而且TGF-β1也能通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)來行使功能。本研究旨在探討miR-29b靶向調(diào)控COL1α1及COL3α1的表達(dá)及作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索其在肝纖維化中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NIH/3T3細(xì)胞系(小鼠成纖維母細(xì)胞)，購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。重組人轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；miR-29b mimics/miR-NC、miR-29b /U6擴(kuò)增引物，均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔源性Collagen I/CollagenIII單克隆抗體、山羊抗兔熒光二抗、羊抗兔IgG，均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔源性HSP47抗體、鼠源性α-SMA/TIMP-1/MMP-9抗體，均購自Santa Cruz Biotechnology公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Master mix，均購于日本ToYoBo公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(lipo 2000)購于美國Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；凋亡試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙熒光素酶基因報(bào)告分析 培養(yǎng)共轉(zhuǎn)染miR-29b mimic/miR-NC質(zhì)粒的NIH/3T3細(xì)胞，用PBS洗兩次，經(jīng)裂解離心取上清后用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性∶腎素?zé)晒馑孛富钚?。

1.2.2 NIH/3T3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 NIH/3T3細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中生長至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代。轉(zhuǎn)染前一天按2×105/ml將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度80%～90%即可轉(zhuǎn)染。將鋪板細(xì)胞分為6組：空白對照(Control)組，miR-29b mimic組，miR-NC組，TGF-β1組，TGF-β1+miR-29b mimics組，TGF-β1+miR-NC組。按照lipo2000試劑盒說明書進(jìn)行miR-29b mimic/miR-NC轉(zhuǎn)染。其中Control 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，TGF-β1組加入含10ng/L TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基，TGF-β1+miR-29b mimics/ miR-NC組是在轉(zhuǎn)染miR-29b mimics/ miR-NC后培養(yǎng)4～6h，然后換用含10ng/L TGF-β1的新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h收集細(xì)胞。

1.2.3 熒光實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率及纖維化相關(guān)因子基因表達(dá) 參考TRIzol(Invitrogen公司)說明書抽提總RNA。①檢測轉(zhuǎn)染效率：以U6為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為：5μM miR-29b/U6上下游引物各0.8μl，模板2μl，SYBR Green I Master Mix 9μl，RNase-free Water加至20μl。實(shí)時定量PCR儀(美國Roche公司)程序設(shè)置：95℃ 20s，(95℃ 10s，60℃ 20s，70℃ 10s)，共39個循環(huán);行融解曲線分析，設(shè)定溫度為70℃～95℃，升溫速率為 0.4℃/次，恒溫時間為 1 s/次。②檢測相關(guān)纖維化指標(biāo)：以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1，反應(yīng)體系為：10μM上下游引物各0.4μl，模板1μl，SYBR Green I Master mix 10μl，RNase-free Water補(bǔ)充至20μl，程序設(shè)定為：95℃ 30s，(95℃ 5s，58℃ 5s，72℃ 15s)，共40個循環(huán)，根據(jù)所獲循環(huán)閾值(CT)分析基因相對表達(dá)水平。

1.2.4 Western-blot檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá) 蛋白抽提試劑提取各組細(xì)胞總蛋白，Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜2h，BSA溶液封閉1h,加一抗4℃孵育過夜。次日 TBST洗膜后加二抗孵育慢搖1h，TBST洗膜20min×3次，采用ECL顯色液和成像系統(tǒng)于暗室曝光，檢測目的蛋白的表達(dá)情況。掃描圖片，ImageJ分析軟件將特異條帶灰度值數(shù)據(jù)化。

1.2.5 免疫熒光染色檢測纖維化相關(guān)蛋白表達(dá) NIH/3T3細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板及轉(zhuǎn)染miR-29b mimics/ miR-NC步驟同前，轉(zhuǎn)染48h后PBS漂洗、甲醇固定15min，再用PBS清洗。BSA封閉液室溫孵育30min后，分別滴加COL1α1抗體、COL3α1抗體、IgG，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日PBS清洗，避光加入熒光二抗，37℃孵育40min后PBS清洗。DAPI染核，避光孵育15min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后48h各組細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞兩次(2000rpm離心5min)，收集1～5 ×105細(xì)胞，加入500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5μl AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min；1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以百分率表示。

1.2.7 CCK-8法檢測NIH/3T3細(xì)胞增殖活力 96孔板各孔中加入100μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長至60%～70%融合時轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分組同上，分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h檢測細(xì)胞增殖活力。吸出96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100μl含10%CCK8的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育0.5～1h，酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，細(xì)胞活力(%)=(A加藥-A空白)/( A0加藥-A空白)×100%，其中A加藥為具有細(xì)胞、質(zhì)粒和(或)TGF-β1的孔吸光度，A空白為沒有細(xì)胞的孔吸光度，A0加藥為僅有細(xì)胞而沒有質(zhì)粒和(或)TGF-β1的孔吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)的比較采用Student-t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-29b對COL1α1及COL3α1靶向調(diào)控作用驗(yàn)證 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-29b可與COL1α1及COL3α1 3′UTR互補(bǔ)結(jié)合。進(jìn)一步通過雙熒光素酶基因報(bào)告證實(shí)miR-29b可與COL1α1及COL3α1 3′UTR特異性結(jié)合，抑制其表達(dá)。

2.2 miR-29b轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染48h，靶基因miR-29b的相對表達(dá)量為(221.462±2.358)，與miR-NC組、Control組比較均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)染48h后NHI/3T3細(xì)胞miR-29b表達(dá)情況

2.3 過表達(dá)miR-29b對NIH/3T3細(xì)胞膠原COL1α1、COL3α1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48h后，與miR-NC組相比，miR-29b mimics組CollagenⅠ、Ⅲ表達(dá)顯著減少(見插頁圖2)，COL1α1 mRNA相對表達(dá)量(2.696±0.15)顯著下調(diào)(圖3A，P<0.01)，COL3α1 mRNA相對表達(dá)量(1.884±0.064)亦顯著下降(圖3B，P<0.05);Western Blot檢測示，與miR-NC組比較，miR-29b mimics組 Ⅰ 型和Ⅲ型前膠原蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(0.42vs0.56, 0.17vs0.24，P﹤0.05，圖3C)。

A.COL1α1 mRNA表達(dá)情況 B.COL3α1 mRNA表達(dá)情況

C.COLⅠ/Ⅲ蛋白表達(dá)情況

2.4 過表達(dá)miR-29b對TGF-β1致NIH/3T3細(xì)胞形態(tài)變化的影響 RT-PCR顯示，miR-29b mimics轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞4～6h后，再經(jīng)TGF-β1 10ng/ml干預(yù)48h，與Control組、TGF-β1組及TGF-β1 +NC組相比，miR-29b表達(dá)顯著上調(diào)(與Control組比較，P<0.05；與TGF-β1+miR-29b mimics比較，P<0.001;圖4)。鏡下觀察，Control組細(xì)胞排列緊密，呈“星芒狀”貼壁生長，胞內(nèi)富含大量脂質(zhì)小滴，TGF-β1作用后細(xì)胞內(nèi)脂滴消失，體積逐漸變大變長，呈長梭形，排列紊亂，幾乎無細(xì)胞脫落。miR-29b mimics作用48h后，細(xì)胞生長稀疏，體積逐漸變大變長，大量細(xì)胞脫落死亡(見插頁圖5)。

圖4 不同處理?xiàng)l件下NIH/3T3細(xì)胞miR-29b相對表達(dá)量分析

2.5 過表達(dá)miR-29b下調(diào)TGF-β1對NIH/3T3細(xì)胞肝纖維化指標(biāo)mRNA及蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，miR-29b mimics轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞4～6h后再經(jīng)TGF-β1 10ng/ml處理48h，與TGF-β1組和TGF-β1+NC組相比，COL1α1、 COL3α1、α-SMA、HSP47、TIMP-1 mRNA表達(dá)下調(diào)，而MMP-9 mRNA表達(dá)上調(diào)(與Control組相比,#P<0.05,##P<0.01；與TGF-β1組相比，*P<0.05,**P<0.01)(圖6)。Western Blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致(圖7)。

圖6 不同處理?xiàng)l件下NIH/3T3細(xì)胞肝纖維化指標(biāo)mRNA表達(dá)變化

圖7 不同處理?xiàng)l件下NIH/3T3細(xì)胞肝纖維化指標(biāo)指標(biāo)蛋白表達(dá)變化

2.6 過表達(dá)miR-29b對NIH/3T3細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，TGF-β1組及TGF-β1+miR-NC組細(xì)胞增殖率逐漸上升，均高于TGF-β1+miR-29b mimics及Control組(P<0.05，見圖8)。

圖8 不同處理?xiàng)l件對NIH/3T3細(xì)胞增殖的影響

圖9 不同處理?xiàng)l件對NIH/3T3細(xì)胞凋亡的影響

2.7 轉(zhuǎn)染miR-29b mimics對NIH/3T3細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，與其它各組相比，TGF-β1+miR-29b mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。

3.討論

HSC活化是肝纖維化發(fā)生的主要驅(qū)動因素，可以導(dǎo)致ECM的合成和降解失衡，引起ECM過度沉積，進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展[5]，在此過程中伴隨有microRNA的變化[6]。Roderburg等[7]發(fā)現(xiàn)在肝內(nèi)多種細(xì)胞中，miR-29b在星狀細(xì)胞中表達(dá)最高，是其在肝細(xì)胞、庫弗氏細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中的100多倍。近期研究表明，miR-29b與纖維化疾病密切相關(guān)，miR-29b在各種纖維化疾病中表達(dá)都明顯下調(diào)，其過表達(dá)可以抑制膠原蛋白及金屬蛋白酶的表達(dá)[8,9]，但miR-29b是否能對膠原纖維進(jìn)行調(diào)控從而在纖維化疾病發(fā)病過程發(fā)揮重要作用尚不清楚。

生理狀態(tài)下，NIH/3T3細(xì)胞表達(dá)一定量的miR-29b，我們發(fā)現(xiàn)，給予miR-29b mimics干預(yù)后，miR-29b表達(dá)顯著上調(diào)，同時Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均明顯降低。藉此本研究中的miR-29b mimics可以作為研究靶向上調(diào)miR-29b基因后觀察該基因效應(yīng)的目標(biāo)分子。我們通過熒光雙染色酶基因報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)只有WT(野生型)COL1α1及COL3α1的3′UTR的啟動子區(qū)域可以和miR-29b結(jié)合，證實(shí)了miR-29b可以對COL1α1及COL3α1 mRNA表達(dá)靶向調(diào)控。

多種細(xì)胞因子參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，其中TGF-β1是最關(guān)鍵的致纖維化細(xì)胞因子。TGF-β1具有多種生物學(xué)功能，一方面參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)形成，另一方面在生物體血管形成、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。TGF-β1不僅促進(jìn)ECM基因激活轉(zhuǎn)錄并高表達(dá)，還通過抑制金屬蛋白酶(MMP)和促進(jìn)組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)減少異常合成的ECM降解,從而加重ECM在損傷組織、器官的沉積。我們以TGF-β1干預(yù)NIH/3T3細(xì)胞作為體外研究肝纖維化病變發(fā)生機(jī)制的細(xì)胞模型，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-29b對TGF-β1致NIH/3T3細(xì)胞COL1α1、COL3α1、α-SMA、TIMP-1、HSP47等表達(dá)升高有抑制作用，說明miR-29b可能不僅僅局限于通過調(diào)控膠原蛋白的表達(dá)而抑制纖維化，在肝纖維化過程中它可能有更廣泛的抑制纖維化機(jī)制，研究以何種方式參與調(diào)節(jié)尚不清楚。

HSP47作為膠原的“分子伴侶”，能與多種類型膠原和前膠原特異性結(jié)合，參與前膠原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中修飾、折疊、裝配等整個加工過程，從而在肝纖維化進(jìn)程中起重要作用[12]。本研究表明，miR-29b過表達(dá)可抑制TGF-β1所致HSP47表達(dá)下調(diào)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。Sekiya等[11]運(yùn)用WST-1分析結(jié)果顯示，miR-29b具有抑制HSC增殖及活性作用，此外，miR-29b可能調(diào)控HSC的數(shù)目。與此類似，我們的CCK-8細(xì)胞檢測及Annexin-FITC細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示miR-29b顯著影響NIH/3T3細(xì)胞的增殖及凋亡，轉(zhuǎn)染miR-29b mimics抑制TGF-β1刺激NIH/3T3細(xì)胞的增殖及增加細(xì)胞凋亡。其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

我們認(rèn)為miR-29b表達(dá)增高可以抑制肝臟纖維化，其抑制纖維化作用不僅與其調(diào)控膠原蛋白有關(guān)，而且還影響TIMP-1、MMP-9、HSP47，α-SMA的表達(dá)。此研究結(jié)果表明，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中，TGF-β1與miRNAs相互作用起到了重要作用。一方面有利于從更開闊的視野深入了解TGF-β1的作用機(jī)制；另一方面也為使用相應(yīng)的miRNAs，增強(qiáng)或阻斷TGF-β1信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而為探索肝臟纖維化發(fā)病機(jī)制和治療提供新思路、新方法。