姜曉晶 梁榮寧 秦 偉

1(中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室和山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，中國科學院煙臺海岸帶研究所， 煙臺 264003)2(中國科學院大學， 北京 10049)

1 引 言

生物體的新陳代謝需要不斷與外界環(huán)境進行物質交換和能量傳遞，這些過程必須借助離子通道(Ion channel)完成。天然離子通道是細胞膜上一類特殊的親水性蛋白質微孔道，選擇性地使特定離子進出細胞。離子通道最典型的特點是具有選擇性和門控制性。選擇性是指通道具有選擇性通透作用，在通道開放時只允許特定離子順電化學差流動；門控制性是指通道的開放和關閉，此特性使得通道能夠靈敏地感受外界刺激并調節(jié)自身的開放和關閉。常見離子通道主要包括兩大類：天然生物離子通道和人工合成離子通道。其中，天然生物離子通道主要由生物膜、跨膜蛋白和通道構成，此類型常用的通道主要有葡萄球菌α-溶血素(α-HL)、氣單胞菌溶素(Aerolysin)、分歧桿菌屬孔道蛋白A(MspA)以及大腸桿菌的外膜蛋白G(OmpG)等。人工合成離子通道是受生物離子通道啟發(fā)而人工制備的離子通道，該類型的離子通道通常采用一定的基底材料(如聚合物[1]、硅基材料[2,3]、玻璃[4]、氧化鋁[5]、石墨烯[6,7]和MoS2[8]等)，利用離子束刻蝕[9]、電子束刻蝕[10]等方法進行制備。兩種類型離子通道各有優(yōu)缺點：天然生物離子通道信號分辨能力強，但穩(wěn)定性差且不適合大規(guī)模生產；人工離子通道尺寸可控、易于陣列化且重現性好，但其制備成本高[11]， 信號噪音較大[12]。

2 離子通道基電化學傳感技術

基于離子通道的電化學傳感技術的工作原理是利用離子通道作為識別元件，待測物流經離子通道時產生感應信號，隨后被換能器接收，轉化為可測量的電化學信號(如電流、阻抗、電位)，然后經過放大、儲存，最后通過電化學儀器顯示記錄下來。根據電化學信號的不同，可大致分為電流型、阻抗型以及電位型離子通道檢測技術。

圖1 離子通道傳感技術應用對象示意圖Fig.1 Application objects of ion-channel sensing

2.1 電流型離子通道傳感技術

圖2為典型電流型離子通道傳感的檢測示意圖及響應圖，其中離子通道連接兩個充滿電解質溶液的隔室，通過施加電壓從而產生通過通道的離子電流，以電流表檢測的電流變化為響應信號。其檢測原理是當通道一側加入待測分析物時，在外加電場的驅動下分析物會穿過離子通道進入通道另一側。當分析物與離子通道尺寸相當時，通道會出現瞬時阻塞，產生下降的電流脈沖，電流脈沖變化的幅度、持續(xù)時間和頻率取決于分析物的特征(如待測物大小及形狀，電荷以及分析物和孔之間的相互作用等)[31～33]。目前，此技術已被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測[34]、癌癥分析[35]、物質分離[36,37]等領域，該技術具有檢測速度快、換能方式簡單等優(yōu)點，但常規(guī)的電流型離子通道傳感技術存在選擇性低、靈敏度差等缺點。

圖2 (A)基于電流法的離子通道傳感檢測DNA示意圖以及(B)典型電流響應[14]Fig.2 (A) Schematic diagram and (B) typical response curve for current-based ion-channel sensing of DNA[14]

1996年，Kasianowicz等[38]首次報道了基于天然生物離子通道α-HL的電流型核酸檢測技術，此工作開創(chuàng)了基于離子通道電化學檢測DNA的新領域。該研究采用電泳法驅動單鏈DNA(ssDNA)和RNA分子通過α-HL通道，當生物分子位置發(fā)生變化時，瞬時電流發(fā)生改變，他們發(fā)現電流頻率與分析物濃度相關且持續(xù)時間與分子的長度成一定比例關系。近年來，龍億濤研究組在生物離子通道基電流型檢測技術方面做了大量研究工作，他們利用氣單胞菌溶素Aerolysin作為離子通道，實現了對未經修飾的寡聚核苷酸分子[39]的直接電化學檢測。然而，需要指出的是，上述檢測方法對靶向目標物質的選擇性不足，體積相似的非目標分子也可以進入離子通道，產生干擾目標信號的離子電流特征，從而降低檢測的準確度。

針對此問題，人們通過在離子通道或分析物上修飾輔助物質進一步提高檢測的選擇性。在天然生物離子通道修飾研究方面，Fahie等[40]報道了生物素配體修飾的生物離子通道OmpG用于高選擇性檢測生物素結合蛋白，該通道可區(qū)分復雜混合物中生物素結合蛋白的幾種結構同源物[41]。對于人工固態(tài)離子通道而言，一般通過共價修飾的方式改進通道識別選擇性。Jiang的研究組[42]對聚合物人工離子通道進行了選擇性修飾，他們在納米離子通道孔道中修飾G-四聯(lián)體DNA，當K+存在時，它會與G-四聯(lián)體DNA發(fā)生作用并使得DNA構型發(fā)生變化，進一步導致跨膜電流降低，從而實現K+的檢測?；陬愃圃?，他們將鋅指蛋白修飾到聚合物人工納米離子通道中，構筑了鋅的高選擇性仿生離子通道[43]，此外他們也將一定長度的單鏈DNA修飾到聚合物納米離子通道中，用于高選擇性地檢測Hg2+[44]。Gao等[45]對玻璃基人工離子通道進行選擇性修飾，他們將大環(huán)二氧四胺衍生物共價修飾到通道內表面，實現了對汞離子的高選擇性檢測。White研究組[46]在玻璃基人工離子通道內表面修飾胺基，通過變化溶液pH值，使離子通道表面胺基質子化或去質子化，從而構建出pH門控效應的電化學傳感器。此外，通過在目標分析物上修飾特定功能性物質，也可以提高離子通道對待測物的選擇性。例如在核酸上結合一種聚陽離子納米載體[47]，聚陽離子載體可以在目標核酸上施加一定的偶極矩，通過電泳力將納米載體-靶DNA復合物驅動到離子通道中，而不具有結合載體的非目標分子被排斥在通道外， 不產生任何干擾信號，從而提高離子通道檢測的選擇性。

在傳統(tǒng)的電流型離子通道分析技術中，分析物穿過離子通道的時間通常較短(～1 ms)，這導致此類型傳感方法的靈敏度一般較低。解決此問題的關鍵在于減慢分析物的運動速度，并延長它們在離子通道孔內的停留時間，從而獲得時間可分辨的信號，并最終實現檢測靈敏度的提高。Meller的研究組等[48]在減慢蛋白質通過離子通道速度方面做了大量研究工作。他們利用激光誘導產生出與分析物電泳運動方向相反的電滲流，從而減慢分析物通過離子通道的速度，使得小分子蛋白能夠被檢測。同時，他們也發(fā)現，通過將電解質pH微調至分析物蛋白的等電點(pI)，也可以減慢分析蛋白的速度[49]。Plesa等[25]在監(jiān)測及減慢DNA通過通道速度方面開展了諸多研究工作。他們通過監(jiān)測標記的DNA通過離子通道過程中的位置變化，從而確定DNA通過離子通道的速度。他們報道了使用谷氨酸溶液來減慢DNA速度的方法[50]，與常規(guī)使用的KCl溶液相比，谷氨酸鹽溶液具有較低的電導率和較高的粘度。粘度的增加使得谷氨酸鹽溶液對DNA分子具有更大的拖曳力，這使得DNA分子通過離子通道的時間延長，從而進一步顯著提高測量靈敏度。最近的研究中，他們通過使用高濃度LiCl緩沖液代替KCl溶液以降低DNA分子通過離子通道的速度，可以獲得更高的測量帶寬[51]。

2.2 阻抗型離子通道傳感技術

電化學阻抗型離子通道檢測體系主要由離子通道和電解質(溶液)兩部分組成，使用阻抗分析儀在室溫下進行阻抗譜的測量和記錄。傳統(tǒng)阻抗分析的一般原理是電子在電極/電解質界面發(fā)生轉移時，由于電子傳導速率與溶液離子傳導速率不同，導致電子轉移不同步，產生電子轉移電阻。在阻抗基離子通道傳感技術中，離子通道的功能化修飾會使得電子轉移電阻略微降低，而功能化離子通道與分析物的相互作用則會使得電子轉移電阻顯著增加，據此可以實現對分析物濃度、帶電情況和結構特征等多種參數的檢測?；谧杩狗ǖ碾x子通道傳感技術的檢測原理以及典型阻抗響應譜如圖3所示。此類型傳感技術具有換能方式簡單、檢測靈敏度高等優(yōu)點[52～55]。然而，該技術也存在復雜電化學阻抗譜分析與解釋困難、等效電路模型缺乏唯一性等諸多不足。目前，阻抗型離子通道傳感技術主要用于生物大分子的檢測[56]。

氧化鋁基人工固態(tài)離子通道由于其具有高度有序、易于修飾以及非特異性吸附弱等特點，在阻抗基離子通道傳感技術中得到廣泛使用。然而未經修飾的氧化鋁離子通道難以用于實現高選擇性的阻抗檢測，已報道的文獻多采用功能化修飾的氧化鋁通道作為傳感元件。Wu等[56]利用小分子單鏈DNA(ssDNA)對氧化鋁離子通道進行修飾，實現了雜交DNA的阻抗檢測，同時他們也發(fā)現降低離子通道孔的密度，有利于實現電化學阻抗譜中離子通道電阻和膜電容的清晰識別。Kant等[57]將大分子鏈霉抗生物素蛋白修飾到多孔道氧化鋁的內表面，并研究了氧化鋁離子通道面積和孔數對化學和生物傳感的影響。他們發(fā)現，與大離子通道陣列相比，小面積和低孔數離子通道可以達到更好的生物傳感性能。最近，有研究者將大分子的人類氣味結合蛋白(hOBP)固定于氧化鋁離子通道表面，實現了醛和脂肪酸的高選擇性、高靈敏度電化學阻抗檢測[5]。hOBP不僅可與親脂性分子結合，而且對親水性的醛和脂肪酸也呈現出較高的親和力，當hOBP與醛或脂肪酸發(fā)生相互作用后，電荷轉移電阻和離子通道電阻的串聯(lián)電阻顯著增加，從而實現對醛和脂肪酸的檢測，該方法對苯甲醛和二十二碳六烯酸的檢出限可分別達到10——9mg/mL和10——12mg/mL量級。

圖3 (A)基于阻抗法的離子通道傳感檢測DNA雜化示意圖以及(B)典型阻抗圖譜[56]Fig.3 (A) Detection diagram and (B) typical impedance spectroscopy for impedance-based ion-channel sensing of DNA hybridization[56]

2.3 電位型離子通道傳感技術

電位型離子通道傳感技術，主要是指基于離子選擇性電極的離子通道傳感技術。離子選擇性電極檢測技術具有操作簡單、成本低廉以及選擇性高等優(yōu)點，特別適合于現場快速分析。近年來，研究者將此類電極與離子通道相結合，發(fā)展了諸多離子通道基離子選擇性電極檢測技術，實現了對無機離子、生物大分子等的高靈敏、高選擇性檢測，可以預見此類技術未來有望應用于臨床化驗、環(huán)境監(jiān)測等領域。與其它電化學離子通道傳感技術相比，該技術具有構建方法簡單、選擇性高等優(yōu)點，但是由于離子通道內識別反應發(fā)生過程中無額外電化學驅動力存在，使得采用此技術所構建的傳感器更新較為困難。

目前，已研發(fā)的離子通道基離子選擇性電極檢測技術主要可分為兩大類，即零電流技術和電流驅動技術。在零電流條件下測定時，一般采用兩電極體系，即將離子通道、離子選擇性電極以及外參比電極之間用導線連接組成一個完整的測量回路，將其置于待測溶液中，離子通道中選擇性識別反應可對待測溶液中離子濃度變化產生影響，并進一步對電位信號變化產生影響，通過電位計測量該電位變化，從而實現待測物檢測。在該條件下，離子的擴散過程僅依靠濃度差。電流驅動條件下的電位檢測技術是指基于計時電位技術的電位分析檢測技術，該技術是通過控制電極表面施加電流的方向、時間以及電流的大小，能夠有效調控通過離子通道修飾的聚合物膜離子選擇性電極的離子通量，從而實現待測物快速檢測[58]。電流驅動條件下的電位檢測體系一般采用三電極體系，由工作電極、參比電極和輔助電極組成。

圖4 (A)基于平衡電位的離子通道傳感檢測小RNA示意圖、(B)測量裝置以及(C)典型電位響應[59]Fig.4 (A) Schematic illustration, (B) measurement setup and (C) typical potential response for equilibrium potential-based ion-channel sensing of microRNA[59]

圖5 離子載體修飾的金離子通道[60]Fig.5 Schematic representation of gold-based ion channel modified with ionophore[60]

Gyurcsanyi等將功能化的離子通道與離子選擇性電極相結合，實現了小RNA (miRNA )的電位檢測[59]，此傳感器的基本原理如圖4所示。該研究利用帶正電的肽-核酸修飾離子通道，帶負電荷的miRNA經過離子通道時會由于電荷中和作用使得離子通道不帶電，此過程采用K+作為指示離子指示電荷中和作用過程，K+選擇性電極作為指示電極測定K+濃度變化，從而實現miRNA的檢測。需要指出的是，此過程核酸待測物識別過程與電極檢測過程是分別進行的，而且識別過程僅依賴電荷作用使得檢測缺乏選擇性。為了解決此問題，他們將親脂性的離子載體、離子交換劑等修飾于金離子通道內表面，構建了集識別和檢測為一體的離子通道基離子選擇性電極(圖5)，離子載體的存在可以保證電極的高選擇性識別，最終實現了Ag+的高選擇性、高靈敏電位檢測[60]。最近，他們又將親水性的多肽修飾于金離子通道內，構建了高選擇性的Cu2+選擇性離子通道傳感器[61]。

Xu等[62]提出了一種基于計時電位分析法的離子通道傳感用于蛋白質的檢測，檢測原理如圖6所示。在該檢測體系中，聚合物膜鈉離子選擇性電極膜表面首先修飾生物素，當溶液中加入親和素后，生物素與親和素會發(fā)生鍵合作用，此作用會抑制電流驅動的Na+從溶液相進入敏感膜相的離子通量，此離子通量的變化可用于定量檢測溶液中的親和素。此外，研究表明，通過降低電極敏感膜的比表面積可以提高檢測靈敏度。鑒于此，他們將固態(tài)氧化鋁離子通道覆蓋于生物素修飾的電極膜表面，有效降低了電極比表面積，進一步提高了電位檢測親和素的靈敏度。

圖6 (A)基于電位法的離子通道傳感檢測抗原抗體相互作用示意圖以及(B)典型電位響應[62]Fig.6 (A) Detection diagram and (B) typical potential response for potentiometry-based ion-channel sensing of antigen-antibody interactions[62]

3 結 語

在過去的十余年中，基于離子通道的電化學檢測技術取得了較大的進展。雖然目前離子通道基電化學傳感器技術在選擇性、靈敏度以及穩(wěn)定性等方面已取得諸多突破，然而，離子通道技術仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如可供選擇的生物離子通道種類十分有限， 以及人工離子通道的穩(wěn)定性和均一性缺乏等，伴隨著DNA工程技術、納米技術以及3D打印技術的發(fā)展，這些問題有望在未來得以解決。此外，離子通道傳感領域面臨的最大問題是只有少數相關化學與生物傳感器已被用于實際樣品分析，而大部分仍然處于概念驗證階段，這就要求研究人員更加深入地研究可應用于現場快速檢測的技術，以更好地將離子通道基化學和生物傳感器應用于實際復雜樣品的檢測中。